99视频内射三四,国产色情av http://www.artisky.cn 原創(chuàng)生物醫(yī)藥文章和國內(nèi)外最新科研動態(tài) Wed, 08 Oct 2025 06:57:33 +0000 zh-CN hourly 1 https://wordpress.org/?v=4.5.32 閱后感想:中國原創(chuàng)藥第一騎士魯先平 http://www.artisky.cn/?p=11675 http://www.artisky.cn/?p=11675#respond Mon, 14 Aug 2017 21:35:26 +0000 http://www.artisky.cn/?p=11675 中國原創(chuàng)藥第一騎士魯先平”這篇文章,感到十分欣慰!文章對先平作了介紹,讓我們從中看到了先平集企業(yè)家與科學(xué)家于一身的光輝形象。]]> 作者:趙英明教授

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閱讀了“中國原創(chuàng)藥第一騎士魯先平”這篇文章,感到十分欣慰!文章對先平作了介紹,讓我們從中看到了先平集企業(yè)家與科學(xué)家于一身的光輝形象。應(yīng)當(dāng)說,文章寫得很好!但由于作者在寫作本文之前,與先平的面談時(shí)間只有兩個(gè)小時(shí),因此對先平的了解很難說已經(jīng)十分全面與深入。特別是先平這樣的成功創(chuàng)業(yè)者,其身上肯定有很多很多非常感人的故事。但不管如何,這篇文章已經(jīng)為書寫先平做出了一個(gè)很好的開端。自然,要想寫透先平,日后還須深度開發(fā)先平創(chuàng)業(yè)歷程這座精神富礦!

本人先后見過先平四次。以往與先平每次在中國見面,均因人多事雜,兩人無法長時(shí)間地深度交談。這個(gè)星期,先平參加了由MIT教授Li Huei Tsai, Cornell 大學(xué)教授Hening Lin和我本人作為共同主席的FASEB Conference on Reversible Acetylation in Health and Disease國際會議,一起在滑雪勝地Big Sky,Montana觀賞勝景,由此我們有機(jī)會一起深談。與素來心儀的人士促膝而坐,真有一種快慰平生的美妙感受;與創(chuàng)業(yè)成功的俊彥當(dāng)面交流,真有一種心扉洞開的美好感覺!

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發(fā)自內(nèi)心地說,先平是我心中的英雄!作為中科院上海藥物所的畢業(yè)生和特聘研究員,我認(rèn)識不少體制內(nèi)做創(chuàng)新藥的騎士和同事。但是先平在體制外,他是中國藥企領(lǐng)域有膽識和膽魄做創(chuàng)新藥的先驅(qū)。在這次深度交流之前,我已經(jīng)知道先平是中國藥企創(chuàng)新藥的開創(chuàng)者,但還不了解先平在中國做創(chuàng)新藥先驅(qū)的強(qiáng)大驅(qū)動力來自何處?不知道先平具有何種優(yōu)秀的潛能與超群的愿力使之成為體制外中國創(chuàng)新藥物的成功先驅(qū)和第一騎士,更不清楚先平為何沒有成為中國創(chuàng)新藥領(lǐng)域第一批英雄就義的“烈士”。通過這幾天的深入交流,我已經(jīng)找到了部分答案,為此,特寫這篇短文,愿意與大家分享我從先平身上發(fā)現(xiàn)的優(yōu)秀特質(zhì)。

首先,先平是對前沿的生物醫(yī)學(xué)、藥物研發(fā)、生物技術(shù)有深入的研究、理解和洞見的科學(xué)家。先平是過去10多年以來我們這個(gè)會議系列的第一位來自中國機(jī)構(gòu)的特邀嘉賓。盡管他回國創(chuàng)業(yè)已經(jīng)16年,但站在這次大會的講臺上,給人的感覺就是一位大學(xué)教授,他可以與參加會議的國際一流學(xué)者暢通溝通交流,并且還在大會上提出了深刻的問題。Robert G Roeder(美國科學(xué)院院士、2003年Lasker獎得主)教授,是我20多年前在Rockefeller大學(xué)讀博士時(shí)的一位老師,也是現(xiàn)在的合作伙伴,我們?nèi)ツ暌惨黄鸷献靼l(fā)表了三篇Molecular Cell 文章。他也參加了本次會議并作為keynote speaker 。先平在開會期間第一次與Bob見面,但兩人相見如故,相談甚歡!在本次會議期間,先平?jīng)]有絲毫懈怠,每天都以飽滿精神認(rèn)真聽講,猶如一位如饑似渴、沉浸在知識海洋里的學(xué)生。作為一個(gè)有成就的企業(yè)家,能夠時(shí)刻保持這種學(xué)習(xí)態(tài)度,是多么的難能可貴!我想,這種好學(xué)好思的胸懷與氣度,真是先平既具宏觀視野又有實(shí)干精神、既能戰(zhàn)略籌劃又會戰(zhàn)術(shù)執(zhí)行的深層原因之一。從先平這里,我更加明白了一個(gè)道理,那就是人與人之間的差別,既有學(xué)習(xí)能力的不同,更是思考水平的差異。難怪有人說,相比于既得利益,思想才是具有改變命運(yùn)的發(fā)動機(jī)。因此,要想做一個(gè)成功的企業(yè)家,你就必須把自己鍛造成一個(gè)出類拔萃的思想家。

其次,先平對行業(yè)現(xiàn)狀的觀察與分析極具洞察力,對行業(yè)未來的預(yù)見與判斷極具穿透力。先平的不同凡響之處,就是通過將自身的遠(yuǎn)見卓識和科學(xué)素養(yǎng)有機(jī)結(jié)合起來,進(jìn)而有效地把科學(xué)轉(zhuǎn)化為技術(shù)、把技術(shù)轉(zhuǎn)化為商品,并且建立起能夠迅速創(chuàng)造價(jià)值的獨(dú)特商業(yè)模式。我想,這正是先平和微芯的差異化戰(zhàn)略與核心競爭力的基礎(chǔ)之所在。

再次,先平的好學(xué)、勤奮和數(shù)十年的知識沉淀造就了他遠(yuǎn)超于常規(guī)創(chuàng)業(yè)者的知識體系、認(rèn)知體系和邏輯思維體系,并成功構(gòu)筑起了個(gè)人能力的護(hù)城河。先平是極少數(shù)具備對創(chuàng)新藥全流程都熟悉的企業(yè)家:從early development(from target identification(or selection)to Phase I, clinieal development,to post-approval sale and maketing。人生苦短,對于大部分創(chuàng)新藥企CEO 或CSO, 有經(jīng)歷從target selection到 Phase I 全程走一遍的人已經(jīng)不多了,大多數(shù)人僅僅做其中一個(gè)環(huán)節(jié)而已。這就是人與人之間經(jīng)歷的差異!在這方面,先平絕對屬于既是專才也是通才!在當(dāng)今以專才為主的時(shí)代,能做成某個(gè)高端領(lǐng)域的通才,是何其難能可貴,是何其鳳毛麟角!就此一點(diǎn),先平實(shí)屬寶貴人才!

最后,先平是屬于天生的領(lǐng)袖型人物。與他聊天,簡直是在享受一頓極其豐盛的精神大餐。靜心聽他娓娓道來,你的心靈會為之受到震撼,你的心門會為之暢開,你的內(nèi)心會為之感佩。和他促膝而坐,你會感受到他發(fā)出的強(qiáng)大氣場,讓你感受到既親切、平和,又極具魅力。我認(rèn)為,這種領(lǐng)袖型的素質(zhì)不是來自于他在事業(yè)上的成功,而是發(fā)自內(nèi)心深處的本參和大格局。我又覺得,企業(yè)家的領(lǐng)導(dǎo)力是天生的,在他們的血液里就流淌著這種素養(yǎng)。像先平這樣具有領(lǐng)袖型氣質(zhì)的企業(yè)家,他們能自強(qiáng)不息、厚德載物,他們能創(chuàng)業(yè)維艱、順勢而為,他們能恭行實(shí)踐、履險(xiǎn)如夷,他們能勝而不驕、持盈保泰,他們能臨事以敬、領(lǐng)導(dǎo)有方,他們能變革管理、順天應(yīng)人。從先平的經(jīng)歷與成就中,我們完全能夠看到他所具有的上述可貴品質(zhì)。在創(chuàng)業(yè)的社會環(huán)境中,存在著這樣一個(gè)普遍道理,那就是良禽擇木而棲、良才擇主而為。真因?yàn)橄绕骄哂蓄I(lǐng)袖型魅力,所以眾多高端人才必然近悅遠(yuǎn)來,聚合在先平的旗幟下,為中國創(chuàng)新藥譜寫出彪炳史冊的輝煌成就!不是梧桐樹,難得鳳凰棲。先平已經(jīng)為私營藥企中國創(chuàng)新培植了一顆梧桐樹,這應(yīng)當(dāng)是功德無量的偉大事業(yè)!特別難能可貴的是,在先平身上,我們既看不到部分成功人士的那種傲慢,也看不到一些企業(yè)家的那種焦慮。這也許是天生的素質(zhì),或許是看透事物本質(zhì)、理解生命本參、明心見性后的悟道結(jié)果。

如果說西達(dá)本胺的成功有一定的偶然性,但先平和深圳微芯的成功完全有其必然性。常規(guī)的思維習(xí)慣于把成功歸結(jié)于一個(gè)人的聰明、機(jī)遇、貴人相助,和勤奮。當(dāng)然,這些要素肯定很重要,要小成功,這些要素可能夠了。但是,做第一個(gè)吃螃蟹的人,想要大成功,光有這些要素可能是不夠的。海歸留學(xué)生企業(yè)家中智商超群,勤奮、有相關(guān)經(jīng)驗(yàn)背景的人不在少數(shù),但是請問有多少醫(yī)藥生物技術(shù)的企業(yè)家具備先平的這些素質(zhì)和經(jīng)歷?如果沒有思想,文化,和格局,能夠做到守正出奇嗎?如果不能參透本參,能夠做到守“拙”和守“靜”嗎?能夠做到淡定和純真恒久的堅(jiān)持嗎?

先平的成功案例說明在中國中小型企業(yè),也是可以做原創(chuàng)新藥研發(fā)的。期待著將來看到更多的先平式俊才彥杰,為人類的健康事業(yè)作貢獻(xiàn)!

【附原文鏈接】:“中國原創(chuàng)藥第一騎士魯先平

【附本文作者趙英明教授簡介】

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Dr. Yingming Zhao is a professor in the Ben May Department for Cancer Research at the University of Chicago. Dr . Zhao has made seminal contributions in the fields of proteomics, epigenetics, and lysine acylation pathways. His laboratory pioneered proteomics technologies for system-wide studies of lysine acetylation substrates that opens new avenues to study non-nuclear functions of lysine acetylation pathway. His laboratory is best known for discovering eight types of new lysine acylation pathways, identifying about 450 new histone epigenetics marks. (accounting for more than 50% of known histone marks), and revealing their key regulatory elements and physiology function.

【附本次FASEB會議主席、合影和日程】

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第十屆藥源生物制藥研討會 http://www.artisky.cn/?p=4905 http://www.artisky.cn/?p=4905#respond Sat, 23 Jan 2016 22:03:13 +0000 http://www.artisky.cn/?p=4905 未來新藥開發(fā):技術(shù)發(fā)展如何為老的概念賦予新生命

主辦單位:美中藥源、芝加哥大學(xué)普利茲克醫(yī)學(xué)院、美中藥協(xié)(SAPA)

地點(diǎn):芝加哥大學(xué)普利茲克醫(yī)學(xué)院 時(shí)間:2017年4月29日

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未來新藥開發(fā):技術(shù)發(fā)展如何為老的概念賦予新生命

主辦單位:美中藥源、芝加哥大學(xué)普利茲克醫(yī)學(xué)院

地點(diǎn):芝加哥大學(xué)普利茲克醫(yī)學(xué)院
時(shí)間:2017年4月29日

詳細(xì)內(nèi)容請?jiān)L問

www.yypharm.org/symposium/2017

仰首是春、俯首成秋,美中藥源迎來了第十屆學(xué)術(shù)會議。久久聯(lián)合、歲歲相長,我們愿意與您一起,再一次共同見證生物技術(shù)和制藥領(lǐng)域的一些風(fēng)風(fēng)雨雨。有人說制藥工業(yè)這一曾經(jīng)的朝陽工業(yè)風(fēng)光不再,更多人議論去年的新藥產(chǎn)出再一次回到十年低谷。試看本次“華山論劍”的各路大俠怎么說,在制藥工業(yè)如何“點(diǎn)石成金”化“腐朽為神奇”,如何賦予一個(gè)傳統(tǒng)的概念,成為現(xiàn)代新藥開發(fā)的主力。本屆研討會還有一個(gè)嘉賓論壇,我們有幸邀請到來自美國頂級大學(xué)的“校領(lǐng)導(dǎo)”、制藥巨頭的“主管”、以及風(fēng)險(xiǎn)基金的“大當(dāng)家”出席,現(xiàn)場為大家解難釋疑。除此之外,美國化學(xué)會著名的藥物化學(xué)雜志還和美中藥源共同舉辦墻報(bào)評獎,獲獎?wù)卟粌H收到來自美國化學(xué)會的證書和水晶獎杯,第一名還將和“學(xué)術(shù)大咖”同臺講演。我們愿與您共話友情、展望將來,期待與您在芝加哥相見!

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 議程:主題演講 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

“重新設(shè)計(jì)針對耐藥菌的超級萬古霉素”

Dr. Dale Boger,Scripps?Research Institute講席教授、化學(xué)系主任、美國科學(xué)院院士、美國科學(xué)和藝術(shù)學(xué)院院士

“免疫抗腫瘤:未來的路在哪里?”

Dr. Thomas J. Hudson,艾伯維制藥集團(tuán)副總裁、腫瘤藥物開發(fā)部主管

“從基因組學(xué)到癌癥治療;靶向癌癥干細(xì)胞藥物的開發(fā)”

Dr. Yusuke Nakamura,芝加哥大學(xué)教授,個(gè)體化治療中心副主任,前日本總理大臣顧問

“探索依魯替尼(Ibrutinib)耐藥機(jī)制并用個(gè)體化的CLL模型研發(fā)新型藥物”

Dr. Y. Lynn Wang,芝加哥大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理系教授,淋巴瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心主任

“不可成藥類藥物的開發(fā):靶向蛋白酪氨酸磷酸酶的治療潛力”

Dr. Zhong-Yin Zhang,美國普渡大學(xué)講席教授、藥物化學(xué)和分子藥理學(xué)系主任

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?議程:嘉賓論壇 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ??

主持人:Thomas von Geldern博士,

Embedded Consulting總裁,雅培集團(tuán)前Research Fellow

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論壇嘉賓:John Flevin博士,芝加哥大學(xué)創(chuàng)業(yè)和發(fā)明部副總裁

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論壇嘉賓:Terry Opgenorth博士,科羅拉多大學(xué)資本副總裁,

雅培集團(tuán)前副總裁,代謝疾病部、抗病毒部、和化合物部主管

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論壇嘉賓:王進(jìn)博士,建信資本合伙人、主管

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 海報(bào)獎 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

美國化學(xué)會(ACS)藥物化學(xué)通訊和藥物化學(xué)雜志贊助

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美國化學(xué)會-藥源藥物化學(xué)獎

? ?第10屆藥源生物醫(yī)藥研討會會議共同主席 ??

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Joel D. Leverson博士

腫瘤藥物開發(fā)部科學(xué)總監(jiān),艾伯維集團(tuán)

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林文斌博士

James Franck 講席教授,芝加哥大學(xué)化學(xué)系

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 主題演講嘉賓介紹 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

Dr. Boger2Dale Boger博士

Boger教授是美國科學(xué)院院士、美國藝術(shù)和科學(xué)院院士。Boger教授是世界最著名的化學(xué)家之一,在藥物化學(xué)、有機(jī)合成、組合化學(xué)、天然產(chǎn)物等多個(gè)領(lǐng)域都作出杰出貢獻(xiàn),因此獲得的榮譽(yù)也數(shù)不勝數(shù)。代表性獎項(xiàng)有Alfred P. Sloan Fellow(1985-87)、A. C. Cope Scholar(1988)、ACS Aldrich Award for Creativity in Organic Synthesis(1999)、Paul Janssen Prize for Creativity in Organic Synthesis(2002)、英國皇家化學(xué)獎?wù)拢?003)、AACR Award for Outstanding Chemistry in Cancer Research(2014),并在2006年和2014年分別入選美國藝術(shù)和科學(xué)院和美國科學(xué)院。Boger教授是著名藥物化學(xué)雜志Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters的創(chuàng)辦人并任主編。

Dr. Hudson1Thomas Hudson醫(yī)學(xué)博士

Hudson博士是世界前十大制藥集團(tuán)艾伯維的副總裁,腫瘤藥物開發(fā)部主管。在加盟艾伯維之前Hudson博士任基因組學(xué)領(lǐng)域的著名研究機(jī)構(gòu)安大略癌癥研究所(OICR)的所長和首席科學(xué)官。Hudson博士是全球最著名的基因?qū)W權(quán)威之一,因?qū)蚪M學(xué)和人類基因組的出色貢獻(xiàn)在國際上享有盛譽(yù)。Hudson博士發(fā)現(xiàn)了許多基因變異造成的疾病,其中包括結(jié)腸癌、II型糖尿病、麻風(fēng)病、多發(fā)性硬化癥、哮喘、和炎性腸病等。Hudson博士是加拿大麥吉爾大學(xué)魁北克創(chuàng)新中心的創(chuàng)建人和主任,其它過往的學(xué)術(shù)職務(wù)和職責(zé)還有Whitehead-麻省理工基因研究中心主任、國際基因組聯(lián)盟、國際癌癥基因組聯(lián)盟、和全球基因組和健康聯(lián)盟的發(fā)起人。Hudson博士也是加拿大基因組、英國基因組、美國健康研究院(NIH)國立人類基因組研究所、和美國STARR癌癥基金會等科學(xué)顧問。Hudson博士發(fā)表了三百余篇學(xué)術(shù)論文。

Nakamura, Yusuke2中村佑介博士

在2012年加盟芝加哥大學(xué)之前,中村佑介博士任日本內(nèi)閣特別顧問兼秘書長、日本醫(yī)藥創(chuàng)新部秘書長、東京大學(xué)教授兼人類基因中心主任等職。

中村佑介博士在過去幾十年里對基因組醫(yī)學(xué)和癌癥研究做出了杰出貢獻(xiàn)。他團(tuán)隊(duì)的研究結(jié)果對全世界基因組醫(yī)學(xué)的進(jìn)展舉足輕重。中村博士是可變數(shù)量串聯(lián)重復(fù)(VNTR)、單核苷酸多態(tài)性(SNP)標(biāo)記研究、以及用基因組學(xué)進(jìn)行臨床干預(yù)等領(lǐng)域的先驅(qū)。這些科學(xué)成果推動了人類致病基因圖譜的繪制和發(fā)現(xiàn)。近年來,中村博士團(tuán)隊(duì)主要致力于通過基因篩查開發(fā)包括單克隆抗體、多肽疫苗、以及小分子靶向藥物等抗癌藥。中村博士在包括《自然》、《科學(xué)》等著名學(xué)術(shù)雜志上一共發(fā)表了超過1300篇論文。

Dr y, lynn wangY. Lynn Wang博士

王博士現(xiàn)任芝加哥大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理系教授,淋巴瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心主任,也是基因組和分子病理學(xué)部的創(chuàng)始主任。在王博士領(lǐng)導(dǎo)下,該部在三年內(nèi)成功地建立了17個(gè)臨床級別的新基因檢測。王教授既是臨床醫(yī)生又是科學(xué)家,對包括BCR信號傳導(dǎo)等多個(gè)B細(xì)胞淋巴瘤和白血病異常信號轉(zhuǎn)導(dǎo)領(lǐng)域作出杰出貢獻(xiàn)。她也是BTK抑制劑依魯替尼耐藥基因(BTKC481S)的發(fā)現(xiàn)者。

王博士于1988年從北京醫(yī)科大學(xué)獲得醫(yī)學(xué)博士學(xué)位,1996年從布蘭迪斯大學(xué)獲得哲學(xué)博士學(xué)位。隨后在賓夕法尼亞大學(xué)進(jìn)行博士后研究并完成臨床病理學(xué)住院醫(yī)師培訓(xùn)。在接受芝加哥大學(xué)終身教職之前,王博士曾在威爾康奈爾醫(yī)學(xué)院工作了11年,并領(lǐng)導(dǎo)分子血液病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室和淋巴瘤轉(zhuǎn)化研究實(shí)驗(yàn)室。

Zhong-Yin Zhang2Zhong-Yin Zhang博士

張博士現(xiàn)任普渡大學(xué)杰出教授、Robert C.和Charlotte P. Anderson 藥理學(xué)講席教授、和藥物化學(xué)和分子藥理學(xué)系主任。張教授于1984年畢業(yè)于南開大學(xué)化學(xué)系,1990年在普渡大學(xué)獲得博士學(xué)位,1994年受邀進(jìn)入愛因斯坦醫(yī)學(xué)院任教,并在2002年升任正教授。張教授在2005年至2015年間是印第安納大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Robert A. Harris?講席教授和生物化學(xué)與分子生物學(xué)系主任。張博士是蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)領(lǐng)域的研究帶頭人,其研究范圍廣泛,從化學(xué)到分子生物學(xué),從蛋白酪氨酸磷酸酶的結(jié)構(gòu)到分子功能,以及到開發(fā)蛋白酪氨酸磷酸酶抑制劑用于臨床。張教授發(fā)表了245篇學(xué)術(shù)論文,是17個(gè)專利的發(fā)明人。

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我認(rèn)識的免疫學(xué)家傅陽心教授 http://www.artisky.cn/?p=2396 http://www.artisky.cn/?p=2396#comments Mon, 14 Sep 2015 02:04:30 +0000 http://www.artisky.cn/?p=2396 傅陽心教授頭銜很多,我知道的就有芝加哥大學(xué)醫(yī)學(xué)院的講席教授、芝加哥大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院的內(nèi)科醫(yī)生、中國科學(xué)院生物物理研究所的客座研究員、中組部特聘“千人計(jì)劃”教授(2009年)。

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yang-xinfu傅陽心教授在辦公室

不得不承認(rèn)我對免疫學(xué)是個(gè)大外行,作為外行聽說過的免疫學(xué)家當(dāng)然很有限,認(rèn)識的就更少了。反之如果我都認(rèn)識了顯然就很出名,傅陽心教授就是這么一位。

傅陽心教授頭銜很多,我知道的就有芝加哥大學(xué)醫(yī)學(xué)院的講席教授、芝加哥大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院的內(nèi)科醫(yī)生、中國科學(xué)院生物物理研究所的客座研究員、中組部特聘“千人計(jì)劃”教授(2009年)、科技部和自然科學(xué)基金委的二審評審專家、《免疫學(xué)雜志》(Journal of Immunology)和《中國科學(xué)》的編輯,當(dāng)然還有美中藥源的理事。

我承認(rèn)作為一個(gè)外行來評價(jià)傅教授的學(xué)術(shù)成就有點(diǎn)不公允,只能就最近幾年讀過而且記得的文章做一點(diǎn)總結(jié):

(一)、傅教授課題組首次揭示樹突狀細(xì)胞(而不是之前公認(rèn)的吞噬細(xì)胞)是抗CD-47抗體表現(xiàn)抗腫瘤療效的驅(qū)動途徑。

眾所周知,免疫系統(tǒng)是人體的防御系統(tǒng),負(fù)責(zé)檢查并清除外來入侵的細(xì)菌、病毒等感染。腫瘤細(xì)胞之所以能逃脫機(jī)體免疫系統(tǒng)的清除,除了激活免疫哨卡(checkpoint)、降低細(xì)胞表面抗原的表達(dá)、改變腫瘤的免疫微環(huán)境之外,也因?yàn)樵诎l(fā)展過程中腫瘤細(xì)胞不斷積累、變異產(chǎn)生了許多“偽裝者”—細(xì)胞表面表達(dá)了大量“別吃我”信號。其中跨膜蛋白CD-47就是當(dāng)中關(guān)鍵的一種。事實(shí)上在多種臨床前實(shí)驗(yàn)中,抗CD-47抗體對包括淋巴癌、膀胱癌、直腸癌、腦癌、乳腺癌、急性淋巴細(xì)胞白血病、和急性髓性白血病等多種腫瘤表現(xiàn)了顯著的治療效果。許多研究指出抗CD-47抗體通過巨噬細(xì)胞顯示抗腫瘤療效。但是傅教授發(fā)現(xiàn),這些研究采用的動物模型(xenograft)使用了T細(xì)胞缺陷的小鼠,這樣并不能反映適應(yīng)性免疫(adaptive immunity)在抗CD-47抗體療效中的作用。

傅教授課題組在8月31日《自然》子刊《Nature Medicine》上發(fā)表文章指出,為了避免人源腫瘤在免疫缺陷的動物模型中對評價(jià)免疫反應(yīng)產(chǎn)生的偏差和誤導(dǎo),他們課題組采用小鼠同源腫瘤進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗CD-47單抗的抗腫瘤療效不是通過吞噬細(xì)胞完成,或者說吞噬細(xì)胞的激活并不是抗CD-47單抗產(chǎn)生療效的主要因素。抗CD-47抗體的治療效果主要依賴樹突狀細(xì)胞。盡管吞噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞一樣也占有抗原,但主要是分解抗原而不是呈遞到T細(xì)胞。抑制CD-47觸發(fā)分泌免疫系統(tǒng)的活化劑—干擾素,從而誘發(fā)CD8高表達(dá)的T細(xì)胞。而樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)的STING信號傳導(dǎo)通路(stimulator of interferon genes)是抗CD-47抗體表現(xiàn)療效的關(guān)鍵。

這個(gè)研究發(fā)現(xiàn)的重要性不言而喻。傅教授課題組不僅證實(shí)了抗CD-47抗體的抗腫瘤作用同時(shí)需要固有免疫和適應(yīng)性性免疫應(yīng)答,更指出調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境和個(gè)體化治療的結(jié)合才是將來征服癌癥的有效策略,在使用抗CD-47抗體之前給藥一次化療對腫瘤治療更有效,為將來免疫療法和化療方案的臨床設(shè)計(jì)提供前瞻性指導(dǎo)。

(二)、揭示誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答是放療療效的重要作用機(jī)制

我們通常認(rèn)為輻射打斷腫瘤細(xì)胞的DNA是放療表現(xiàn)療效的主要作用機(jī)制。傅教授和合作者首次觀察到,激活免疫系統(tǒng)其實(shí)在放療中起著重要甚至是關(guān)鍵性的作用。他們團(tuán)隊(duì)通過一系列體外實(shí)驗(yàn)和小鼠模型闡明,樹突狀細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的主力偵查部隊(duì),而STING又對激活針對放療的免疫反應(yīng)至關(guān)重要。在放療過程中,斷裂的DNA片段激活樹突狀細(xì)胞的病毒DNA傳感器cGAS,進(jìn)而接通STING,從而啟動一系列生物化學(xué)信號導(dǎo)致生成免疫因子IFN-β。IFN-β增強(qiáng)了樹突狀細(xì)胞激活免疫系統(tǒng)殺傷T細(xì)胞(killing T-cell)清除腫瘤細(xì)胞的能力。實(shí)驗(yàn)還證實(shí)STING或IFN-β的激動劑都能明顯提高腫瘤對放療的敏感性,從而開啟了靶向腫瘤的另一個(gè)研究方向。發(fā)現(xiàn)了腫瘤放療可以誘導(dǎo)機(jī)體的適應(yīng)性免疫應(yīng)答,是腫瘤放療的重要效應(yīng)機(jī)制之一。相反,不適當(dāng)?shù)幕煼桨缚赡芤种品暖熣T導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答,降低綜合治療效果,這些發(fā)現(xiàn)對腫瘤的臨床治療具有重要的指導(dǎo)意義。

(三)、首次發(fā)現(xiàn)LIGHT在腫瘤免疫治療中的關(guān)鍵作用。

淋巴結(jié)是機(jī)體的最主要淋巴器官之一,也是產(chǎn)生抗原特異性免疫應(yīng)答的區(qū)域。傅教授研究團(tuán)隊(duì)在世界上首次證實(shí),TNF超家族分子LIGHT通過其受體淋巴毒素beta受體(LTbetaR),上調(diào)血管和淋巴管表達(dá)的粘附因子或趨化因子,從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)中淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞從外周向引流淋巴結(jié)的遷移。這個(gè)發(fā)現(xiàn)揭示了炎癥反應(yīng)過程中細(xì)胞遷移和淋巴結(jié)重塑變化的新的分子機(jī)制,為進(jìn)一步探索感染、腫瘤等病理過程中淋巴結(jié)的形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化及其在免疫應(yīng)答中的作用奠定了理論基礎(chǔ)。同時(shí)也使LIGHT成為抗腫瘤免疫療法的重要分子靶點(diǎn)。

(四)、首次發(fā)現(xiàn)赫賽汀(Herceptin)治療乳腺癌的最新免疫機(jī)制。

傅教授研究團(tuán)隊(duì)和中科院生物物理所的王盛典教授研究團(tuán)隊(duì)合作,第一次發(fā)現(xiàn)抗腫瘤重磅產(chǎn)品赫賽汀的抗癌療效也依賴于人體的適應(yīng)性免疫應(yīng)答,對抗體腫瘤治療的作用機(jī)制提出了新的假說。傅陽心、王盛典聯(lián)合課題組通過動物實(shí)驗(yàn)?zāi)M,赫賽汀可以消除正常小鼠的乳腺腫瘤,但對免疫缺陷的小鼠幾乎沒有反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),赫賽汀首先誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡,釋放“危險(xiǎn)”信號,進(jìn)而激活人體的固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答,這些繼發(fā)的免疫反應(yīng)對最終控制和消除腫瘤起著決定性作用。這些發(fā)現(xiàn)也說明,在赫賽汀、化療聯(lián)合治療過程中不適當(dāng)?shù)拇髣┝炕熞矔庖呒?xì)胞,削弱赫賽汀抗腫瘤作用誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)。如果化療藥物和赫賽汀同時(shí)或之后使用,雖然能協(xié)同殺傷原位腫瘤,但被該藥物活化的免疫細(xì)胞可能被化療藥物殺傷,降低人體的抗腫瘤免疫記憶反應(yīng),增加腫瘤的復(fù)發(fā)。而在赫賽汀之前使用,在增加抗原位腫瘤作用的同時(shí),不影響免疫記憶反應(yīng),不增加腫瘤的復(fù)發(fā)。這些發(fā)現(xiàn)為提高乳腺癌治療效果、改善赫賽汀治療方案提供了有力的理論依據(jù)和全新思路。

(五)、發(fā)明抗體—干擾素融合蛋白有望根治耐藥腫瘤。

抗腫瘤靶向療法是抗腫瘤的五大支柱療法之一。然而多次使用比如單克隆抗體的靶向療法之后,殘存的腫瘤細(xì)胞大多產(chǎn)生對抗體的耐藥性,使抗體藥物抗腫瘤治療面臨挑戰(zhàn)。傅教授課題組通過把抗體與I型干擾素相融合,設(shè)計(jì)出了新一代的以抗體為基礎(chǔ)的免疫靶向制劑(Ab-IFNβ)。臨床前研究發(fā)現(xiàn),這種新型抗體—干擾素融合蛋白可以重新激活和鏈接腫瘤微環(huán)境內(nèi)受抑制的固有免疫和適應(yīng)性免疫機(jī)制,打破腫瘤免疫耐受狀態(tài)。Ab-IFNβ直接靶向腫瘤微環(huán)境內(nèi)的樹突狀細(xì)胞,通過增強(qiáng)抗原的交叉提呈來重新活化細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。此外,Ab-IFNβ還能誘導(dǎo)PD-L1信號通路的阻斷,克服治療獲得性藥物耐受,為根治抗體耐藥腫瘤提供了新思路。

(六)、揭示免疫系統(tǒng)、腸道細(xì)菌、消化與肥胖的關(guān)系。

傅教授是在美國為數(shù)不多的既是科學(xué)家也是臨床醫(yī)生的華裔學(xué)者之一。我第一次意識到傅教授也是臨床醫(yī)生是在芝加哥WTTV電視上(視頻)。電視專欄采訪傅教授(醫(yī)生)關(guān)于腸道菌群對控制兒童肥胖的作用。雖然早在50年前農(nóng)民們就知道給牲畜服食抗生素能加速牲畜的體重增長,但是直到最近幾年傅教授研究團(tuán)隊(duì)才發(fā)現(xiàn),體重增加不僅需要熱量超負(fù)荷,還需要腸道細(xì)菌和免疫反應(yīng)之間的一種精細(xì)的、可調(diào)的、以及可傳遞的相互作用。這些研究發(fā)現(xiàn)不僅能催生一類新的治療方案以此預(yù)防有害感染,甚至相關(guān)的疫苗和抗生素也有可能會加入到熱量控制或減肥手術(shù)中成為調(diào)控體重增加的一條新途徑。

傅教授祖籍福建泉州,在1982年從上海第一醫(yī)科大學(xué)畢業(yè)后進(jìn)入中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院和北京協(xié)和醫(yī)院任住院醫(yī)師,隨后移居美國。在1990年獲得美國邁阿密大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)博士。傅教授于1991至1993年在丹佛國立猶太人免疫與呼吸醫(yī)學(xué)中心從事博士后研究,1994年至1998年在華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院擔(dān)任住院醫(yī)生。從1998年至今一直在芝加哥大學(xué)病理學(xué)系任教,在2005年從助理教授罕見地直接升任教授(終身),在2014年被評為講席教授。

傅陽心教授是國際上腫瘤免疫領(lǐng)域最杰出多產(chǎn)的科學(xué)家之一,發(fā)表了大量具有重要創(chuàng)新性的研究論文,成為芝加哥大學(xué)少數(shù)同時(shí)在臨床和科研領(lǐng)域取得突出成績的醫(yī)生和科學(xué)家。傅教授團(tuán)隊(duì)最近五年僅在《自然,Nature》、《科學(xué),Science》、《自然醫(yī)學(xué),Nature Medicine》、《自然免疫學(xué),Nature Immunology》、Immunity等SCI影響因子大于15以上的頂尖學(xué)術(shù)雜志上發(fā)表的論文就有三十余篇,外加在JEM、JCI、Gastroenterology、《血液,Blood》、《美國科學(xué)院院報(bào),PNAS》等影響因子在6-15之間的科學(xué)文章五十余篇。論文的總引用數(shù)超過17,000次(h-index75)。從2003年至今,傅教授被各種國際免疫學(xué)、腫瘤學(xué)相關(guān)學(xué)術(shù)會議以及大學(xué)和科研院所邀請作專題學(xué)術(shù)報(bào)告近百次。傅教授作為中國科學(xué)院客座教授、國家自然科學(xué)基金委的評審專家每年多次到中國作專題報(bào)告,承擔(dān)和開展實(shí)驗(yàn)室和臨床研究。

傅教授最近獲得德克薩斯州的高級研究員獎(senior investigator award)并將“移師”德州大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心,開始他的科研“第二春”。傅教授的“移情別戀”不僅是芝加哥大學(xué)的損失,也是美中藥源的損失。雖然相信傅教授會繼續(xù)為美中藥源獻(xiàn)計(jì)獻(xiàn)策,象過去一樣提供許多建設(shè)性的意見,但畢竟不能經(jīng)常相聚。借此機(jī)會我代表美中藥源全體同仁衷心祝愿傅教授科研之春常青,繼續(xù)為免疫學(xué)尤其是抗腫瘤免疫療法的發(fā)展,為人類最終治愈腫瘤再寫新的篇章。

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http://www.artisky.cn/?feed=rss2&p=2396 2
FDA專家組以8票贊成4票反對支持Novo Nordisk的長效胰島素Tresiba (degludec) 和Ryzodeg http://www.artisky.cn/?p=156 Fri, 09 Nov 2012 03:46:58 +0000 http://yypharm.com/blog/?p=156 slide3

 

【新聞事件】:今天FDA專家組以8票贊成4票反對支持 Novo Nordisk 的長效胰島素 Tresiba (degludec) 和 Ryzodeg。 但是專家組一致同意Novo Nordisk 需要做更多的臨床實(shí)驗(yàn)排除該產(chǎn)品能增加心血管事件這個(gè)副作用。多數(shù)專家同意該產(chǎn)品可先上市使用,安全性實(shí)驗(yàn)可在上市后做。Novo Nordisk 希望明年上半年能在美國上市。在投票前公布的資料顯示根據(jù)16個(gè)臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析,Tresiba 和標(biāo)準(zhǔn)胰島素比可能增加心血管事件。增加幅度開始估計(jì)為10%,后來估計(jì)有可能達(dá)到30%,但統(tǒng)計(jì)上都很不確定,即可能是實(shí)驗(yàn)噪音。FDA 同時(shí)發(fā)現(xiàn)Tresiba并沒有減少低血糖事件。美國的投資分析師對該產(chǎn)品在美國市場的表現(xiàn)持悲觀態(tài)度。Tresiba 和 Ryzodeg 分別在今年9月10月被日本和歐洲藥監(jiān)部門推薦上市。
【相關(guān)事實(shí)】
- 一型糖尿病在胰島素發(fā)現(xiàn)之前曾經(jīng)比癌癥還可怕。這些可憐的孩子每天吃400千卡的食物。因?yàn)樘I了,這樣的飲食只能在醫(yī)院醫(yī)生監(jiān)督下才能執(zhí)行。即使這樣也只能延長孩子幾個(gè)月的壽命。
- 早期糖尿病是檢測尿糖,由于當(dāng)時(shí)分析手段限制,檢測尿糖也很復(fù)雜,得在醫(yī)院做。
- 胰島素的開發(fā)共用了2年,多倫多大學(xué)花了1400 美元,禮來首期投入25000 美元。現(xiàn)在 Tresiba 這個(gè)安全性一個(gè)實(shí)驗(yàn)就得半年到一年的時(shí)間。
- 最早使用胰島素的一個(gè)病人叫 Elizabeth Hughes,她11歲得了糖尿病。她每次得用20分鐘分三次注射5毫升胰島素,注射完肌肉麻木和腫大需要一小時(shí)的步行才能緩解,但是她非常高興因?yàn)橐葝u素可以幫助她吃正常飲食。她一直活到73歲。

【藥源解析】:這個(gè)案例顯示 FDA 比歐洲和日本對藥物上市條件要求更高。我們曾分析過歐洲專家的態(tài)度明顯更友好,投資者對其未來估計(jì)也比美國樂觀。由于FDA對安全一向嚴(yán)格,所以即使多數(shù)專家組成員同意可以先上市再做安全性實(shí)驗(yàn),F(xiàn)DA 很可能仍然要求先做心血管事件實(shí)驗(yàn)再允許上市。這是整個(gè)藥監(jiān)部門對me-too產(chǎn)品不友好的一個(gè)具體體現(xiàn)。由于已有胰島素和塞諾非的長效胰島素在市場上,F(xiàn)DA不需要急著上這個(gè)產(chǎn)品。FDA對 Tresiba 嚴(yán)厲的主要原因是有長效胰島素Lantus已經(jīng)上市,并非長效劑型本身沒有價(jià)值。所以路人丙以前說過的下面關(guān)于 Tresiba 的評論依舊有效。

“胰島素于1922年首次使用,是最老的生物藥物之一。90年后的今天還有人做它的類似物令人深思。一個(gè)主要原因是所有一型糖尿病患者需要終身使用胰島素,二型糖尿病患者絕大多數(shù)最后會胰腺beta細(xì)胞失效而必須使用胰島素。二是胰島素注射對患者依然是個(gè)負(fù)擔(dān)雖然測試血糖是更大的負(fù)擔(dān)。三是口服降糖藥物現(xiàn)在還不能維持beta細(xì)胞功能。最后,胰島素十分安全。胰島素的故事一方面說明“無論世界潮流如何變化,好藥依舊風(fēng)流”,另一方面也說明注射藥物在慢性病治療中的尷尬處境。90年的努力不過是為了減少注射頻率。除非小分子藥物能即增加胰島素靈敏度,又能維持 beta 細(xì)胞功能,尋求更方便胰島素的努力不會停止。”

【未來影響】:這個(gè)例子說明美國市場依舊是世界上最難進(jìn)入的市場,同時(shí)也反映了一個(gè)重要趨勢即沒有區(qū)分的me-too產(chǎn)品會越來越遭到藥監(jiān)部門的刁難。20年后Novo Nordisk 回頭看這個(gè)產(chǎn)品得慶幸FDA沒要求他們做一個(gè)與 Lantus 頭碰頭的安全性實(shí)驗(yàn)。藥源依然認(rèn)為非侵入性胰島素會成為未來的方向。雖然Exubera商業(yè)上很不成功,但是還有一些吸入式胰島素在研發(fā)中,其中以 Mankind 的產(chǎn)品最有希望。當(dāng)然以后小分子胰島素受體激動劑也是完全有可能的。

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適用于篩選其它的粘合劑(結(jié)合劑) http://www.artisky.cn/?p=154 Thu, 08 Nov 2012 03:45:01 +0000 http://yypharm.com/blog/?p=154 UGT71G1_UGT85A4_UPDg copy

 

篩選流程圖:

. 重組靶蛋白Bcl-2的制備(首先是GST-融合, 然后是無GST的蛋白)
. 篩選噬菌體庫
. 分離過緊的粘合劑
. DNA測序以確定粘合劑序列
. 通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)進(jìn)行親和力的估計(jì).

材料:
. 大腸桿菌株 BL21(DE3)被用于生產(chǎn) Bcl-2 蛋白的表達(dá)宿主
. 細(xì)菌培養(yǎng)基, 胰蛋白胨和酵母提取物都購自Difco (碧迪公司, 富蘭克林湖,新澤西州)
. M13肽庫篩選試劑盒 (博士噬菌體表達(dá)肽庫試劑盒)從新英格蘭Biolabs (富康,麻州)購得.
. 抗M-13單克隆抗體, 多克隆谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST), 抗Bck-2 及抗-Bax 這些特異性抗體都購于圣克魯斯生物技術(shù)(圣克魯斯, 加州)
. 所有其它的化學(xué)品, 包括異丙基-1-半乳糖苷(IPTG)則購自Sigma (圣路易斯,密蘇里州).

GST融合蛋白的純化:
重組Bcl-2(rBcl-2)蛋白質(zhì)的產(chǎn)生和純化如同在其它地方描述過的一樣. 簡單的說, 把Bcl-2蛋白質(zhì)的成熟形式進(jìn)一步克隆到pGEX-4T-2質(zhì)粒(Amersham生物科學(xué)公司,皮斯卡塔韋, 新澤西州)內(nèi)EcoR1和Xho1 的位置(pGEX-4T2-Bcl2), 這樣就使得靶蛋白被表達(dá)成GST-融合蛋白. 質(zhì)粒然后被轉(zhuǎn)化進(jìn)BL21(DE3) E.coli菌株, 培養(yǎng)在含有100微克/毫升氨芐青霉素的1升Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基在37C下, 直到OD600 達(dá)到0.7. 然后通過加入0.5mM IPTG 繼續(xù)在37C下培養(yǎng)4-5小時(shí)以誘導(dǎo)細(xì)胞超表達(dá)靶蛋白. 用離心收獲細(xì)胞, 產(chǎn)生的沉淀在-80C過夜. 重新懸浮細(xì)胞于10毫升磷酸鹽緩沖液(PBS, 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 2mM KH2PO4, pH7.4). 然后置于4C, 用溶菌酶處理, 攪拌30-60 分鐘,再用超聲波處理. 之后, 4C下用15,000g離心15分鐘. 用0.45微米的注射器過濾器過濾去除不溶性的顆粒. 剩下的上清液被裝進(jìn)預(yù)先用PBST(PBS 含0.5%TritonX-100)緩沖液平衡的GST瓊脂糖凝膠柱(Amersham 生物科學(xué)). 凝膠柱隨后用至少三倍柱容量的PBST緩沖液洗. 之后用五倍柱容量的PBS洗以去除多余的TritonX-100. Bcl-2被用20mM谷胱甘肽,0.15MNaCl,50mMTris(pH8.0)以線性梯度洗脫,含有靶蛋白的部分被收集并通過鹽柱以去除谷胱甘肽.

制備無GST的蛋白:
根據(jù)制造商的說明(Sigma公司), 無GST的Bcl-2(rBcl-2)用凝血酶處理的方法產(chǎn)生. 加入1mM 苯甲脒以終止裂解反應(yīng). 無GST蛋白用一個(gè)離子交換柱, 單Q(Amersham 生物科學(xué))及0.5MNaCl線性梯度及25mM Na-phosphate,pH7.4 去鹽柱純化. GST-Bcl-2的裂解采用兩個(gè)不同的能特異性的分別識別GST-標(biāo)記(抗-GST)和Bcl-2-標(biāo)記(抗-Bcl-2)的抗體的西方印跡方法證實(shí).

噬菌體肽庫的篩選:
博士-12噬菌體表現(xiàn)出的2.7X109肽復(fù)雜性的肽庫(PhD12, 新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司)被用于篩選. 0.5微克純化的Bcl-2蛋白被通過疏水作用固定在聚苯板孔里, 然后用2%牛血清蛋白(BSA, 2%牛血清白蛋白于含50mMTris-HCl[pH7.5],150mM NaCl, 0.1%Tween-20的Tris-緩沖的鹽水[TBST])在室溫下復(fù)蓋1小時(shí). 這些孔用TBST洗三次, 再用于生物篩選. 一個(gè)特定量的噬菌體被加入孔里,在室溫下輕輕搖動培養(yǎng)一小時(shí). 然后用TBST 洗這些孔10次.結(jié)合的噬菌體在化學(xué)洗脫液里洗脫(0.2M甘氨酸[pH2.2],1毫克/毫升BSA). 洗脫物馬上用1M Tris-HCl[pH9.1]中和. 在隨后的幾輪生物篩選(第2- 第5 輪中, TBST里的洗滌劑或鹽的濃度增加如下: 0.3%Tween-20(第2輪),0.5%Tween-20(第3輪),0.5%Tween-20 加500mMNaCl(分別為第4和第5輪). 在最后一輪時(shí), 加入額外數(shù)量的Bcl-2蛋白使結(jié)合的噬菌體被洗脫. 從每一輪洗脫的噬菌體用E.coli ER 2738株進(jìn)行擴(kuò)增以便隨后的生物篩選有足夠的復(fù)制本. 在繁殖5小時(shí)后, 用11,000g離心15 分鐘以去除細(xì)菌細(xì)胞. 按照制造商提供的程序, 培養(yǎng)上清液用聚乙二醇(20%[W/V]聚乙二醇-800和2.5M NaCl) 沉淀部分純化了噬菌體.用10,000rpm 速度離心愛30 分鐘后, 噬菌體沉淀物重新懸浮于TBS 緩沖液( 50mM Tris-HCl[pH7.5], 和150mM NaCl). 并可用于下一輪的篩選.

DNA測序
培養(yǎng)了一個(gè)晚上的 E.coli ER 2738 用LB培養(yǎng)基稀釋成1: 100, 并分成1毫升的小等份. 加入能顯示Bcl-2結(jié)合肽的單個(gè)噬菌體. 細(xì)胞在37C培育5 小時(shí), 然后離心收集含有噬菌體的上清液. 加入200微升PEG/NaCl(20% [W/V] 聚乙二醇-800 和 2.5M NaCl)以沉淀噬菌體. 用碘緩沖液(含10mM Tris-HCl[pH8.0], 1mMEDTA, 4MNaI) 重新懸浮由此產(chǎn)生的沉淀, 然后用酒精沉淀. 噬菌體的單鏈DNA由此獲得并溶于dH2O(蒸餾水), 噬菌體的單鏈DNA序列用擁有96 Pill測序引物的自動序列測定服務(wù)(Macrogen 公司, 首爾, 韓國)測定. 用新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室提供的遺傳密碼資料推測出肽的氨基酸序列.

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)估計(jì)結(jié)合親和力:
制備能表達(dá)Bcl-2 結(jié)合肽的噬菌體, 并以測量噬菌體形成單位(pfu)來決定其濃度, 當(dāng)進(jìn)行肽結(jié)合親和力估計(jì)時(shí), 表達(dá)Bcl-2結(jié)合肽的噬菌體被如同指出的以濃度依賴方式加入含有Bcl-2蛋白(0.5微克/孔)的96孔平板. 隨后用TBST洗這些孔10次. 室溫下用一個(gè)抗-M13抗體(鼠單克隆抗體, 1:5000稀釋于TBST, 0.2微克/毫升, Amersham生物科學(xué)公司)探查1 小時(shí). 用TBST 緩沖液洗5次后, 抗鼠IgG-辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合物被加進(jìn)并培育1小時(shí). 用TMB底物溶液(3,3’,5,5’-四甲基苯唑啶[TMB]/過氧化氫, Chemicon公司, 比爾里卡, 麻州)進(jìn)行顯色反應(yīng). 15分鐘后, 加入1 M硫酸以終止反應(yīng). 用一個(gè)Biotrak 多孔平板閱讀儀(Amersham,生物科學(xué)) 在450nm處測定光密度. 另外, 一系列稀釋的用生物酰化的/或FITC-標(biāo)記的肽被Bcl-2蛋白固定于96孔平板培育 2小時(shí).結(jié)合到靶蛋白的生物酰化的肽通過與鏈霉親和素-HRP抗體共育(稀釋在1:1000TBST, BD Pharmingen, 圣迭戈, 加州)而檢測出來. 而FITC-標(biāo)記的肽的結(jié)合親和力由有一在495nm激發(fā)和在520 nm發(fā)射的最大軟V5系統(tǒng)的熒光微板閱讀儀(Molecular Devices, 桑尼維爾, 加州)測定.

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用HTS 篩選組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑 http://www.artisky.cn/?p=152 Thu, 08 Nov 2012 03:42:22 +0000 http://yypharm.com/blog/?p=152 understanding_the_health_and_service_needs_of_diverse_populations_of_pharmaceutical_opioid_users

主要適應(yīng)范圍: 抗白血病的后生癌癥藥物

基本原理和流程圖: 實(shí)驗(yàn)胚胎的畸變正引起越來越多的關(guān)注,因?yàn)樗赡苁窃诎┌Y發(fā)展中的關(guān)鍵因素..
近來, 組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶的不正常已與幾種類型的癌癥聯(lián)系起來了. 單核細(xì)胞白血病鋅指蛋白(MOZ)是組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶MYST家族中的一個(gè)成員.MYST酶系通常調(diào)節(jié)基因在細(xì)胞增殖和分化的表達(dá). MOZ組成的活化引起白血病干細(xì)胞的形成,使得MOZ成為一個(gè)極好的治療髓細(xì)胞性白血病的指標(biāo).這個(gè)程序表達(dá)了一個(gè)有力的同質(zhì)化測驗(yàn)來測量合成的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶的組蛋白肽底物的乙酰化. 初步篩選是要找出抑制劑, 而二級反篩則是用于消除干擾檢測的化合物, 從而進(jìn)一步證實(shí)抑制劑.

方法和程序:
. 蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化: 人類MOZ的MYST 片段(507-778 殘基)是通過一個(gè)N-終端融合蛋白質(zhì)與E.coli衍生的NusA溶解性標(biāo)記連接于一個(gè)His6. 通過鎳固定的金屬離子親和層析(Ni-IMAC)進(jìn)行蛋白質(zhì)純化. 為了產(chǎn)生一個(gè)pNusA-His^-hMOZ表達(dá)載體, 一個(gè)cDNA序列編碼這些不同的區(qū)域, 通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增. 使用的引物有側(cè)翼5’Ncol 和3’Notl雙酶切點(diǎn). 然后克隆到一個(gè)pETM60衍生的載體里. 如果使用表面等離子體共振(SPR)實(shí)驗(yàn), 人類MOZ來于MYST區(qū)域(殘基497-780)被表達(dá)為一個(gè)N-終端His6融合的蛋白質(zhì)(從結(jié)構(gòu)基因組學(xué)聯(lián)盟獲得, 同意號D12-APC027).同樣, 對于SPR實(shí)驗(yàn), 人類MYST來源的MOZ區(qū)域(殘基 177-447)被表達(dá)為一個(gè)連接N-終端His 6-標(biāo)記的融合蛋白. 為了產(chǎn)生pHis6-hMOF表達(dá)載體, 把側(cè)翼有5’Ncol 和3’Notl 雙酶切點(diǎn)的引物用PCR擴(kuò)增這兩個(gè)區(qū)域并克隆進(jìn)一個(gè)pProEXHTa 載體(Invitrogen, 卡爾斯巴德, 加州).
. 為進(jìn)行蛋白質(zhì)的生產(chǎn),pNusA-His6-hMOZ. pHis6-hMOZ 及 pHis6-hMOF表達(dá)的載體被轉(zhuǎn)化進(jìn) E.coli BL12(DE3)細(xì)胞. 把這樣產(chǎn)生的菌株培養(yǎng)在一個(gè)10升大的布勞恩Biostat B 發(fā)酵瓶,并用0.1mM異丙醇1PTG誘導(dǎo)在15C過夜.

. 為高通量篩選而進(jìn)行NusA-His6-hMOZ的純化
一個(gè)37克(濕重)的大腸桿菌細(xì)胞沉淀物被重新懸浮在200毫升裂解液(25mM Tris (pH8), 500mMNaCl, 0.02% 疊氮化鈉,0.01% Triton-X100, 5%甘油, 10mM 咪唑,5mM 二硫蘇糖醇(DTT), 加上蛋白酶抑制劑片(Roche,Basel,),20 微升 Benzonase (Merck, whitehouse Station,新澤西州), 100 毫克溶菌酶(Sigma, St.Louis,密蘇里州)). 細(xì)胞在冰上攪拌1小時(shí),然后讓細(xì)胞通過一個(gè)Avesstin C5細(xì)胞勻漿器以15,000psi 3次進(jìn)行機(jī)械性溶解. 由此產(chǎn)生的細(xì)胞裂解液用48,000g離心20分鐘. 上清液用5微米過濾器過濾. 這種NusA-His6-hMOZ蛋白質(zhì)然后在一個(gè)5毫升HisTrap柱上利用Profinia蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)(Bio-Rad, Hercules, 加州)純化. 隨后是兩步凝膠過濾步驟,先是一個(gè)Superdex 200 26/60 柱, 然后是一個(gè)Superdex 75 16/60別(GE, 醫(yī)療). 總的說來, 用這種方法從37 克E.coli沉淀物最后在最終緩沖液(25mM Tris(pH8), 500mMNaCl, 0/02%疊氮化鈉, 5%甘油, 及,5mM DTT) 里生產(chǎn)出約15毫克純化的NusA-His6-hMOZ蛋白質(zhì). pCAF酶購自Millipore(比爾里卡,馬薩諸塞州).

. 小分子抗體庫
WEHI 93K HTS 和CRC-CTx 153K HTS 的抗體庫用于這個(gè)實(shí)驗(yàn). 其實(shí)任何其它的小分子化合物抗體庫既使有些適當(dāng)?shù)淖儺愐部梢允褂? 簡言之, 從不同的產(chǎn)商淘汰鉛樣化合物, 而其它化合物85% 以上類似于任何其他產(chǎn)商, 按照Tanimoto系數(shù)進(jìn)行判籪并進(jìn)一步考慮去除. 采用功能組過濾器以消除活性化合物. 額外的檢測干擾過濾器用于CRC-CTx 153K HTS抗體庫最終步驟之前. 化合物溶解在干凈的DMSO, 并以5mM的濃度儲存在可控氣壓條件下(TTP LABTECH 化合物, 墨爾本, 英國)

. HAT 活性:
不同酶的HAT活性測定使用以AlphaScreen 為基礎(chǔ)的檢測方法(珀金埃爾默, 馬薩儲塞州沃爾瑟姆). 這個(gè)試驗(yàn)反應(yīng)在 384 孔低容量檢測板以8微升的容量進(jìn)行(格雷納, Frikenhausen, 德國或康寧,洛厄爾, 馬薩諸塞州). 反應(yīng)在檢測緩沖液(100 mM Tris-HCL (pH7.8), 15mM NaCl, 1mM EDTA, 0.01%Tween-20, 1mM DTT,及0.02%M/V雞蛋白蛋白)里進(jìn)行. 除非另有說明, 反應(yīng)用 15uM AcCoA(Sigma),50nM N-終端組蛋白H4肽鏈(序列SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKV-GGK-生物素, Millipore公司).10nMMOZ酶及乙酶-賴胺酸-特異性抗體(a-ACK(最終稀釋度1:3500)細(xì)胞信號技術(shù), 丹佛斯,MA;a-H4ACK8-1(最終稀釋度 50納克/毫升),Abcam, 英國劍橋; a-H4ACK8-2(最終稀釋度 1:3000) Millipore公司).
. 在第一步的HTS試驗(yàn)中,15納升抗體庫化合物被干撒在從第1到第22列的測試板. 而第23和24列則加入同等量的DMSO. 使用這些準(zhǔn)備好的測試平板允許化合物儲存中心在底物和酶被快速不斷地添加進(jìn)去之前能進(jìn)行較大批量的準(zhǔn)備和運(yùn)輸.

. 對于隨后的試驗(yàn), 用DMSO進(jìn)行抗體庫化合物的11 點(diǎn)稀釋系列.在加入酶啟動反應(yīng)前, 100nL容量被一針型工具加進(jìn)含底物的測試平板. 在所有的平板上都要進(jìn)行陽性(無底物)及陰性(AcCoA去除)對照反應(yīng), 并如同化合物處理的反應(yīng)孔,用相同劑量的DMSO.

. 在加入所有的試劑后, 平板用粘合劑密封, 然后室溫下培養(yǎng)60分鐘. 4微升額外的緩沖液(含有最終濃度為4微克/毫升的AlphaScreen Protein A受體珠及鏈霉親和供體珠(珀金埃爾默))被加入, 培育5 小時(shí)后,用一個(gè)EnVision2103多標(biāo)記平板翻譯儀按照HTS AlphaScreen模式進(jìn)行讀取(珀金埃爾默). 每一個(gè)抗體庫化和物的抑制百分比相對于每個(gè)平板的陽性和陰性對照基礎(chǔ)上計(jì)算出來.

. 滴定試驗(yàn)
IC50 值取決于恰當(dāng)?shù)囊种瓢俜直扰c化合物的濃度(雙重的11點(diǎn)稀釋) 對一個(gè)4參數(shù)的計(jì)算方式.
. 監(jiān)督檢測質(zhì)量: Z 因子測定

滴定CoASH-它不溶于DMSO里.在測定緩沖液里加入20 mM的原液. 取0.5微升加入反應(yīng)孔. 對于某些試驗(yàn),TruHits珠(珀金埃爾默)被用于測定對檢測方式的干擾.

. 輻射的測定:
HAT的活性及小分子的抑制活性基本上象以前描述的那樣用輻射試驗(yàn)進(jìn)行測定. 簡言之, 用1.5微克重組的組蛋白H3.3和H4 (New England, Biolabs, Ipswich,MA) 與120納克純化的NusA-His6-hMOZ融合再一起在HAT 緩沖液里(50mMTris-HCl(pH8.0).50mMKCl, 0.1mMEDTA, 5%甘油,1mMDTT)培養(yǎng). 加0.125微居里acetyl-1-14C-AcCoA(珀金埃爾默), 使得總?cè)莘e為30微升,在30C培養(yǎng)30分鐘. 加進(jìn)額外的Laemmli緩沖液, 并在10% Bis-Tris(2-3)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)解析每一種反應(yīng)的一半之前煮沸5 分鐘以終止反應(yīng). 在凝膠被Phosphor篩選前要干燥24-48 小時(shí). 然后使用富士的FLA-3000成象儀(富士, 東京, 日本)成象. 此外, 在干燥前, 用SafeStain把蛋白質(zhì)在電泳中的痕跡染色進(jìn)行可視化加載.兩種圖象用ImageJ(國家衛(wèi)生研究院, 貝塞斯達(dá), 馬里蘭州)進(jìn)行定量. 對于相關(guān)的蛋白信號而言, 14碳信號是標(biāo)準(zhǔn)..

. 用生物感應(yīng)表面等離子體共振測定化合物的特征.

用一個(gè)BiacoreT 100系統(tǒng)(GE Healthcare)進(jìn)行化合物結(jié)合特征的測定

按照制造商的建議, 用一個(gè)基本的胺偶合鏈霉親和素并固定到一個(gè)CM5芯片上.靶蛋白質(zhì)MOZ及一個(gè)對照蛋白質(zhì)被1:1 克分子比例的磺酸基-NHS-LC-LC-生物素(ThermoScientific,羅克福德,IL)有限標(biāo)記,測定其非特異結(jié)合, CSF1-R激酶的結(jié)構(gòu)區(qū)域.用體積排除色譜從非混合試劑里純化這些蛋白質(zhì),成并固定在泳動的緩沖液里(50mM HEPES (pH7.5), 150mM NaCl, 10mM MgCl, 5mMDTT, 0.05%Tween-20, 5% DMSO). 在鏈霉親和素芯片表面, 在4C和100uM濃度時(shí), 化合物被分別注射進(jìn)這些點(diǎn)里. 除了溶劑校正外,參考通道的信號被從蛋白質(zhì)通道的信號里減去. 用洗滌軟件(www.biologic.com.au)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析.

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噬菌體展示技術(shù)篩選單鏈抗體的方法 http://www.artisky.cn/?p=150 Thu, 08 Nov 2012 03:39:35 +0000 http://yypharm.com/blog/?p=150 這是綜合匯編并驗(yàn)證修改的方法。對于具體項(xiàng)目,可作相應(yīng)的修改。
1. 細(xì)菌宿主細(xì)胞的準(zhǔn)備:

在新的篩選過程開始之前, 從凍箱中取出TGI 細(xì)胞, 接種到M9 小量瓊脂培養(yǎng)平板. 在37 c 中培養(yǎng)一個(gè)晚上, 然后把平板密封閉并儲存在4c 冰箱里。在含50 ml 2x YT 液體的250 ml 的燒瓶里接種單個(gè)克隆的TGI細(xì)胞( 在每一次篩選中, 至少需要10 毫升細(xì)胞培養(yǎng)液. 如果需要的話, 可接種更多的燒瓶).

另一種方法: 在篩選前一天, 接種10 毫升單克隆TGI 細(xì)胞到一個(gè)50 毫升的Falco 管, 在37 度中以280 轉(zhuǎn)/分的速度旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)過夜。 在進(jìn)一步洗脫噬菌體之前約3 小時(shí),把50 毫升2xYT加入含有250 微升經(jīng)過一夜培養(yǎng)的TGI 細(xì)胞液,并把它放到37 度中離心(280轉(zhuǎn)/分)培養(yǎng),用OD600 控制其生長。當(dāng)細(xì)菌生長達(dá)到中等對數(shù)期(OD600=0.5-1.0, 約5x108細(xì)胞/毫升)時(shí), 馬上使用這個(gè)培養(yǎng)液.要不然, 把這個(gè)培養(yǎng)液放在冰里直到需要把噬菌體提出進(jìn)行感染 (6.1 章) 或是滴定(7.2及 7.3 章).

2. 抗原的準(zhǔn)備:

在DDI 過程中使用已定的程序, 詳細(xì)記錄在此次項(xiàng)目中使用過的所有抗原和對照抗體.

2.1 生物素標(biāo)記抗原

按照產(chǎn)品提供的步驟用Sulfo-NHS-LC-Biotin 反應(yīng)計(jì)(Pierce 21335) 生物素標(biāo)記約100微克抗原。我們的目的是使每個(gè)抗原接合2 個(gè)生物素。在反應(yīng)中用超過10 倍克分子濃度的生物素反應(yīng)計(jì)算, 并用去鹽旋轉(zhuǎn)柱去除沒有反應(yīng)的生物素。用生物素定量測定器材來確定生物素比抗原的比例。只有生物素酰化超過1,且抗原溶解低于總數(shù)的20% 的抗原才被認(rèn)為合格。如果生物素標(biāo)記不合要求, 應(yīng)重新生物素標(biāo)記,并適當(dāng)調(diào)整生物素酰化計(jì)的克分子濃度。
質(zhì)量控制:
把生物素標(biāo)記的及非生物素標(biāo)記的抗原排列在 (1) PAGE: 觀察降解及聚集;(2) 8 個(gè)一組: 觀察其與鏈霉敏感性的特異結(jié)合; (3) 用任意的一種抗原特異性功能或結(jié)合的測試來觀察不變的功能.
生物素標(biāo)記的抗原用于 5.1.3 章.

2.2 固相涂層抗原微孔板篩選

抗原涂層飽和度測試采用ELISA應(yīng)用Maxisorp 或類似的高結(jié)合平板做的。試驗(yàn)準(zhǔn)備11 個(gè)抗原用PBS 做2 倍稀釋(從 10 微克/毫升稀釋到0.01微克/毫升);每一種稀釋度三個(gè)樣品,另外加對照(無或用不相關(guān)的抗原),每個(gè)樣品50 微升稀釋液,在4度培養(yǎng)一個(gè)晚上。封閉微孔板, 用相應(yīng)的第一、二、抗體來檢測抗原.如果可能的話, 可用一系列的商品化的抗體來檢測不同的表面抗原決定簇。注意不同抗原的飽和度范圍.如果在最高濃度時(shí)看不到ELISA 的飽和度信號, 可試用其它非PBS 的緩沖劑, 同時(shí)應(yīng)重復(fù)飽和度的測試過程。
涂層-每一次篩選,(不同噬菌體抗體庫或?qū)嶒?yàn)條件), 每孔涂200微升飽和濃度的抗原, 并在4度下過夜。用300微升4% 脫脂奶粉封閉微孔板,室溫1 小時(shí),然后用PBS 緩沖液清洗。這種涂了抗原并封閉好的微孔平板用于5.2 章.

3. 準(zhǔn)備噬菌體抗體庫:
在篩選的所有步驟中使用相同的封閉液。
封閉液:
篩選生物素標(biāo)記抗原用含有4% BSA (Sigma, A7030) 的 PBS-LT (0.01% Tween 20, PBS)
固相篩選用用含有4%脫脂奶粉的PBS-LT (Bio-Rad 170-6404)

3.1第一輪篩選:

把噬菌體抗體庫的抗體, 按50μL(1E12)等份分裝,每次用一管,不要把抗體庫混合到一起。把所用的那管抗體簡單的離心一下,把抗體加入裝含有150 微升4% 封閉液的1.5毫升 Eppendorf 管中進(jìn)行封閉,室溫下放置1 小時(shí),取10微升用于輸入滴定.

另外一種方法:
抗體庫中所有的抗體 (Kappa & Lambda) 都按約150微升(1E12)分裝。每次篩選時(shí),從每個(gè)抗體庫中取出相同劑量進(jìn)行混合。取一管簡單離心后,把 Kappa 和 lambda的抗體庫混合在一起, 并加入PBS 到800 微升, 再加入200 微升PEG/NACL, 在冰中放置 30 分鐘。然后在4 度中用24000xg 離心 10 分鐘,小心緩慢地盡可能地吸去除上層漂浮液,然后在 1.5 毫升Eppendorf 管內(nèi)用吸量器吸動,使沉淀物重新懸浮到200微升4% 封閉液,室溫下放置 1 小時(shí),千萬不要用旋渦器,最后取出10微升用于輸入滴定。

3.2 余下的篩選步驟:
把50微升2 次 PEG 沉淀的噬菌體(6 章) 混合到 150 微升4% 封閉液;室溫下培養(yǎng)1 小時(shí);取 10 微升用于滴定.

4.抗體庫的準(zhǔn)備:
在所有的篩選步驟中, 用相同的固定液.
固定液:
篩選生物素酰化的抗原: 用PBS-LT(0.01%Tween 20,PBS) 含有4% BSA (Sigma, A7030).

固相篩選: PBS-LT (BioRad, 170-6404) 加有4%脫脂奶粉.

4.1, 篩選的第一步:
. 把抗體庫等分為50微升(1E12)一份. 每一份用于每一個(gè)篩選, 不要混合抗體庫.
. 簡單離心每一份抗體庫.
. 在 1.5毫升Eppendorf 管加150微升4%固定液. 再加入抗體庫以固定抗體庫.
. 在室溫下培養(yǎng) 1小時(shí).
. 取10微升用作輸入滴定.

另一種方法是:
把 Kappa 和 Lambda 抗體庫都等分為150微升(約為1E12). 每一次篩選用從每個(gè)抗體庫混合的一份.
. 簡單地離心每份抗體庫.
. 混合Kappa 和Lambda抗體庫, 再加PBS 到800微升.
. 加200微升 PEG/NaCl, 然后在冰上培養(yǎng)30分鐘.
. 24000xg 4C下離心10分鐘.
. 小心緩慢地盡可能地去除所有的上清液.
. 在1.5毫升Eppendorf管里用吸量器重新懸浮沉淀物到200微升4%固定液.
. 室溫下培養(yǎng)1小時(shí).
. 取10微升作輸入滴定.

4.2. 篩選的隨后步驟:

. 混合50微升雙重PEG-沉淀的噬菌體(來于6章)到150微升4%固定液.
. 室溫下培養(yǎng)1小時(shí).
. 取10微升作輸入滴定.

5.0 篩選

5.1 用King Fisher 液相篩選
5.1.1. 封閉用鏈霉包裹的磁性珠子(Dynabeads) 來取消選擇和篩選.
每一個(gè)篩選用50 微升磁珠
. 在原有的容器內(nèi)用旋渦器混合珠.子
. 吸 50 微升珠子到Eppendorf 管, 放入磁柱并去掉儲存時(shí)的緩沖液.
. 用1毫升 PBST 清洗, 洗3 次. 即: 用吸量器使珠子重新懸浮, 讓磁柱
收集珠子并去掉清洗液.
. 把洗過的珠子重新懸浮到200微升4%的封閉液(相同于封閉噬菌體抗體的
液體).
. 在搖動器上室溫培養(yǎng)一個(gè)小時(shí).
. 用手輕彈管子以便收集管底的液體.
. 把整管的懸浮液加到磁柱里以收集磁珠和去掉封閉液.
. 用50 微升PBS-LT 重新懸浮磁珠.

5.1.2. 在King Fisher 平板去除抗體庫的選擇 (為去除磁珠特異性的噬菌體)
. 把干凈的管子放入磁柱, 加入25 微升封閉的磁珠.
. 去除緩沖液,加入200 微升封閉的抗體庫并用吸量器混合.
. 把混合的液體倒在 King Fisher 平板A 行.
. 在 King Fisher 平板的B行倒入200微升PBS-LT.
. 進(jìn)行去除選擇的程序( 混合 1 小時(shí), 把磁珠轉(zhuǎn)移到B行).
. 從A行收集去除選擇的抗體庫, B行的磁珠丟棄.

5.1.3. 在 King Fisher 平板中篩選

每一柱( 有8 個(gè)孔) 只用于每個(gè)單一的篩選過程,從平板中去掉沒有用的柱.
用 Trypsin 洗脫 (CATtryp 抗體庫) 和用 HCL 洗脫( Dyax 抗體庫) 程序的篩選分別使用不同的平板.
. 混合 25 微升封閉的磁珠和175 微升PBST, 并放入平板B 行.
. 分別加200微升PBST 到C 行和D 行.
. 分別加 200微升PBS-LT 到E, F, 及G 行.
. H行空著,直到King Fisher 篩選項(xiàng)目需要時(shí).
.把去掉選擇性的抗體庫(5.1.2章)及15pmol 生物素酰化的抗原混合(3.1  章),然后加進(jìn)A行.
.把平板放入King Fisher 儀器,并按照其指示(同時(shí)也附在此文件中,用第一個(gè)SoluSolid_HCLTrp 程序來做篩選的第一步.根據(jù)需要,用第二個(gè)或者第三個(gè)SoluSolid_HCLTrp 程序來做篩選的

其它步驟.
.為洗脫CATtrp抗體庫,用0.1M的磷酸鈉(pH=7)稀釋(1:500)冰凍的Trypsin 部分.然后馬上加到平板的H 行.
. 在H 行洗脫噬菌體.
. 小心! 用HCL(Dyax 抗體庫洗脫噬菌體的程序結(jié)束后需要馬上進(jìn)行中和.
. 取10 微升用于輸出滴定.
. 把洗脫的噬菌體儲放在冰里直到準(zhǔn)備擴(kuò)充.
(*) 磁珠的最大結(jié)合能力取決于抗原的大小. 25 微升磁珠最多能結(jié)合16.6 pmol IgG 或50 pmol 生物素酰化的肽鏈(縮氨酸). 15 pmol 150KD 蛋白質(zhì)是22微克, 15 pmol 15 KD 蛋白質(zhì)是0.22 微克, 15pmol/200 ul 是75nM.
5.2. 用微平板進(jìn)行固相篩選
. 把封閉的抗體(4 章) 加入到涂有抗原的單個(gè)孔里, 并封閉微平板(3.2 章).
. 在室溫下靜止?fàn)顟B(tài)培養(yǎng)1小時(shí).
. 用PBS 人工手洗培養(yǎng)孔5 次, 再用PBS-LT 洗5次.
. 用新鮮配制并稀釋的Trypsin 洗脫CATtrp 抗體庫噬菌體(200 微升,10微克/毫升, 30 分鐘, 37C). 用兵HCL 洗脫Dyax 抗體庫(200 微升, 0.1M HCL, 5 分鐘在室溫,然后移到加有65微升, 1M Tris pH=8 的Eppendorf管中.
. 取10 微升用于輸出滴定.
. 存于冰中直到準(zhǔn)備進(jìn)行感染指(6 章).

6. 洗脫噬菌體的擴(kuò)充

6.1. 篩選物劃碟 – 第1 天(即篩選的同一天, 5 章)
. 把100 微升TGI細(xì)胞培養(yǎng)液涂到培養(yǎng)皿中作為沒有感染的細(xì)胞對照.
. 把全部洗脫的噬菌體(5章)放入50 毫升Falcon 管里, 加10微升TGI 細(xì)胞培養(yǎng)液 (2 章), 在37C 中緩慢搖動150 轉(zhuǎn)/分 1 小時(shí).
. 用70微升感染的TGI 細(xì)胞做克隆挑選僅用于第2和第3步的篩選步驟.
. 把Falcon管里余下的細(xì)胞在2500 轉(zhuǎn)/分離心15 分鐘.
. 用 2 毫升2XYTCG(2X YT+100 微克/毫升卡苯尼西林及2%葡萄糖) 重新懸浮沉淀物. 然后把細(xì)胞涂于2XYTCG BioAssay 瓊脂平板.
. 把100 微升無感染的TGI 細(xì)胞對照涂在2XYTCG 小培養(yǎng)皿上.
培養(yǎng)過夜后,這個(gè)培養(yǎng)皿應(yīng)該沒有細(xì)胞生長.
. 把所有的培養(yǎng)皿置于30 C 過夜.

6.2. 篩選物的擴(kuò)充 – 第二天
. 用細(xì)胞刮刀把細(xì)胞從BioAssay瓊脂平板上刮下, 并用強(qiáng)烈的旋渦方式把細(xì)胞重新懸浮與加有10毫升2XYTCG的50 毫升管里.
. 取2 個(gè)800 微升的細(xì)胞懸液放于標(biāo)記好的低溫管中, 再加400微升50% 的甘油.混合之后把這些加有甘油的儲備細(xì)胞置于-80C(篩選物的備用品).
. 找出細(xì)胞懸浮液的OD600(要精確的測定OD600, 必須充分稀釋樣品, 使測定值保持在0.06-0.6 之間).
. 把細(xì)胞接種到裝有50 毫升2XYTCG 的250 毫升燒瓶里. OD600 在開始時(shí)應(yīng)在0.05-0.1 之間,
. 把細(xì)胞培養(yǎng)在37C 280轉(zhuǎn)/分使OD600 達(dá)到0.5-1.0 的范圍.
. 從這種細(xì)胞培養(yǎng)中取10 毫升加到預(yù)熱在37C 的50毫升管子里, 丟掉剩余的.
. 在MOI=20 時(shí),加入輔助噬菌體(M130K07 用于Dyax, M13K07trp 用于CAT 抗體庫). 當(dāng)OD600 =0.5 時(shí),加5E10 噬菌體到10 毫升TGI 培養(yǎng)液.
. 在150 轉(zhuǎn)/分的緩慢轉(zhuǎn)動中繼續(xù)37C培養(yǎng)一小時(shí).
. 用2000xg離心10 分鐘.
. 盡量去除并丟棄上清液, 用吸量器在1毫升2XYTCK(2XYT+100微克/毫升卡苯尼西林和50微克/毫升卡那霉素里重新懸浮沉淀物.
. 把1 毫升細(xì)胞接種到裝有25毫升2XYTCK 的250毫升燒瓶里. 在25C中用 280轉(zhuǎn)/分生長過夜.

6.3. 收獲及凈化擴(kuò)充的噬菌體—第三天
. 把細(xì)胞培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到一個(gè)50 毫升管中并在冰中稍微冷卻,
. 用實(shí)驗(yàn)臺上(小)離心機(jī)在4C下以4750轉(zhuǎn)/分離心30分鐘. 如果上清液是混濁的, 把它 轉(zhuǎn)入另一個(gè)干凈管子里并重復(fù)這一步驟.
另一種方法是用地面(大)型離心機(jī)在4C下以8000轉(zhuǎn)/分離心20 分鐘.
. 把20毫升上清液(不要攪動細(xì)胞沉定物)轉(zhuǎn)入到另一個(gè)新的50毫升管里, 加5毫升PEG/NACL 混合, 然后在冰中培養(yǎng)一小時(shí).
. 在4C下用4750轉(zhuǎn)/分離心15分鐘.
. 小心地去除所有的上清液.
. 加1毫升PBS-LT, 用吸量器重新懸浮沉淀物. 然后轉(zhuǎn)入Eppendorf管.
. 4C下用24000xg離心10分鐘, 以去掉殘留的細(xì)菌.
. 取800微升上清液于200微升PEG/NACL混合. 在冰中培養(yǎng)15分鐘.
. 4C下4000xg離心10分鐘以收集噬菌體.
. 小心吸去并丟棄所有的上清液.
. 用吸量器使沉淀物重新懸浮于0.1毫升PBS-LT中并轉(zhuǎn)入另一新的Eppendorf管.
. 4C 下24000xg離心10 分鐘以去掉剩余的沉淀物.
. 把上清液裝入一新的管子里. 這就是雙重PEG-沉淀的噬菌體,用于4.2.章.

7. 測定篩選的輸入和輸出

7.2 的方法是用于測定輸入和輸出滴定. 由于輸入滴定相當(dāng)高,輸入噬菌體必須象7.1. 描述的那樣稀釋.
7.3.的方法用于在第二及第三輪篩選之后做克隆的挑選

. 篩選輸入滴定: 用PBS-LT 稀釋 10 微升封閉的噬菌體(4 章, 含有約5E10 cfu), 3 次乘以系數(shù)100 (10 微升+ 990微升->10 微升+990微升->10 微升+990微升, 加10 微升(約5E04 cfu)到A 列(7.2 章).
計(jì)算輸入滴定用 7.2 章的公式, 再用得數(shù)乘以1E06. 這就是噬菌體cfu在190 微升篩選所用的封閉的抗體庫中(4章)的數(shù)量.
*例如, 有5個(gè)噬菌體在G 列, 輸入噬菌體的滴定就是1.95E06(5*380*4-5)輸入抗體滴定應(yīng)是1.95E12,

7.2. 一個(gè)培養(yǎng)皿滴定的方法:

這個(gè)方法用于在96 孔平板中最多有12個(gè)噬菌體樣品的滴定.
稀釋液被點(diǎn)進(jìn)一個(gè)單一的大的瓊脂培養(yǎng)皿. 每一個(gè)滴定有84倍稀釋, 從2E08到4E02之間的滴定都包括了.
. 稀釋平板, 用低容量, 象PCR, 96孔培養(yǎng)板.
, 用盡量多的柱 (1-12), 如果你有很多噬菌體需要數(shù).
B-H 列每孔加15 微升PBS-LT. 加10微升噬菌體裁(5.1.3, 5,2, 及 7.1.章)

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大規(guī)模的短暫轉(zhuǎn)染293F 細(xì)胞以快速生產(chǎn)單克隆抗體 http://www.artisky.cn/?p=148 Thu, 08 Nov 2012 03:37:40 +0000 http://yypharm.com/blog/?p=148 293f

材料:
自由式293 培養(yǎng)基, Cat NO 12338
Opti-MEMI, Cat NO 31985
200微克無內(nèi)質(zhì)粒DNA
300 微升 293 Fectin 試劑

轉(zhuǎn)染前一天:
把細(xì)胞稀釋到10X106個(gè)細(xì)胞/毫升, 以確保這些細(xì)胞處于對數(shù)生長期。

轉(zhuǎn)染當(dāng)天:
1. 在37C中預(yù)熱 Opti-MEMI 和自由式293培養(yǎng)基.
2. 用預(yù)熱的自由式293 培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞到最終容積 300毫升,和細(xì)胞密度為1.0X106細(xì)胞/ 毫升。 95%以上的細(xì)胞必須是活的.
3. 試劑-A的準(zhǔn)備: 加200 微克DNA 到10毫升預(yù)熱的Opti=MEMI, 輕輕混合.
4. 試劑-B的準(zhǔn)備: 加300 微升 293Fectin 到 10毫升預(yù)熱的Opti-MEMI, 輕輕混合.
5. 室溫下培養(yǎng)不超過 5 分鐘.
6. 5 分鐘后, 把試劑-A 加到試劑-B 里,輕輕混合. 在室溫下培育30 分鐘.
7. 30 分鐘后, 把試劑混合物加到細(xì)胞中.

轉(zhuǎn)染后第三天:
加 300毫升預(yù)熱的自由式 293 培養(yǎng)基到燒瓶,最終容量為600 毫升.

轉(zhuǎn)染后第六天:
1. 在 1000 轉(zhuǎn)/分離心細(xì)胞 5 分鐘. .收獲過濾的上清液. 把細(xì)胞重新懸浮于同體積的預(yù)熱的自由式 293 培養(yǎng)基, 儲存細(xì)胞于 4C.
2. 最終容積是 600毫升- 收獲 600毫升上清液.

轉(zhuǎn)染后第十天:
用1000轉(zhuǎn)/分離心細(xì)胞 5 分鐘, 收獲過濾的上清液. 從一次轉(zhuǎn)染共收獲1.2 升含抗體的上清液.

注意: 表達(dá)水平是以不同的抗體而異, 一般介于50-400 毫克/升的范圍內(nèi).

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基于全細(xì)胞熒光分析的DPP1抑制劑篩選 http://www.artisky.cn/?p=146 Thu, 08 Nov 2012 03:35:23 +0000 http://yypharm.com/blog/?p=146 潛在應(yīng)用:COPD (慢性阻塞性肺病)

基本原理:

二肽基肽酶(Dipeptidyl peptidase 1 , DPP1) 是一種溶酶體木瓜蛋白酶家族的半胱氨酰蛋白酶參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解,并且是慢性阻塞性肺病的較感興趣的靶點(diǎn)。目前,僅有離體的DPP1酶活性分析,主要方法是用合成的底物如二肽或肽連結(jié)到氨基-甲基-香豆素或其他熒光基團(tuán)上。然而,目前還沒有簡易的基于全細(xì)胞的分析方法檢測溶酶體DPP1活性除了使用基于侵入性活性探針或生理的產(chǎn)物如中性粒細(xì)胞彈性蛋白的產(chǎn)生。體外重組酶活性分析存在一定缺點(diǎn)。作者研究了許多DPP1熒光底物,探討了作為進(jìn)入溶酶體增強(qiáng)體內(nèi)檢測DPP1酶活性的潛在可能性。這個(gè)實(shí)驗(yàn)方案主要介紹一種簡易的非侵入性的使用底物H-Gly-Phe-AFC檢測新鮮的或冷藏保存的人THP-1細(xì)胞中DPP1活性熒光分析。這種基于細(xì)胞的熒光分析方法可以在96孔板中進(jìn)行操作并可作為理想的適合檢測細(xì)胞DPP1抑制劑。

方法:

材料
所有分析試劑及細(xì)胞生長所用培基購買于 Sigma-Aldrich,H-Gly-Phe-AFC購于NeoMPS, Polypeptide Laboratories Group (San Diego, CA),H-Gly-Arg-AMC購于Bachem (Bubendorf, Switzerland)。 (Gly-Arg)2-rhodamine 合成于 Medicinal Chemistry Department at AstraZeneca R&D Charnwood (Loughborough, UK) ,一個(gè) GSK DPP1 抑制劑專利 WO 2006094003。Human recombinant DPP1 (hrDPP1)生產(chǎn)于DECS Group at AstraZeneca R&D (M?lndal, Sweden)。

培養(yǎng)和冷凍保存的THP-1細(xì)胞
THP-1 人單核粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞,來自于 American Type Culture Collection (TIB 202 F-11838; ATCC, Manassas, VA) 。生長條件是RPMI + 1% (v/v) glutamine + 10% (v/v) fetal calf serum (FCS) ,37°C ,5% CO2 培養(yǎng)箱。在合適的生長密度,收集THP-1細(xì)胞并重懸于PBS中(pH 7.4) 。冷凍的THP-1細(xì)胞密度約為1.0 × 107/mL,凍存條件為 80% (v/v) of FCS, 10% (v/v) DMSO, and 10% (v/v) 生長培基 (RPMI) ,?150°C。在分析之前,凍存的細(xì)胞于37°C 水浴復(fù)蘇,300 g 離心5分鐘,去除凍存液,以合適密度重懸于PBS中。新鮮的或凍存的細(xì)胞要求有95%以上的細(xì)胞活力,用 Cedex cell counter檢測 (Trypan blue uptake)。

DPP1 酶活性分析
重組人DPP1酶活性分析主要檢測氨基-甲基香豆素或氨基-氟香豆素底物肽釋放出的酶活性,氨基-甲基香豆素?zé)晒饷芏菶x λ350 nm 和Em λ450 nm,氨基-氟香豆素 Ex λ400 nm 和 Em λ505 nm。檢測過程在黑色384孔板中,終體積為50 μL,溫度為22°C。分析條件包括:assay buffer (25 mM piperazine buffer, pH 5.0; 50 mM NaCl, 5 mM dithiothreitol [DTT]; 0.01% [v/v] Triton X-100), 100 μM H-Gly-Arg-AMC or H-Gly-Phe-AFC (~equivalent to Km), and hrDPP1 (~0.1 nM)。化合物溶解于DMSO中并稀釋在分析緩沖液里,使得DMSO終濃度為1% (v/v)。以10為底的半對數(shù)稀釋方法稀釋抑制劑,用4參數(shù)logitic非線性擬合方程計(jì)算pIC50 。標(biāo)準(zhǔn)的非可逆選擇性DPP1抑制劑(vinyl sulfone [VS])作為該分析方法的陽性對照。常規(guī)來說,在加入底物肽之前,先把化合物與重組DPP1預(yù)孵育30min,再開始反應(yīng),然后放置于22°C孵育60min。此后,空板迅速置于熒光讀板儀上,使用合適的激發(fā)光和發(fā)射光波長讀數(shù)。用基于Michaelis-Menten的方程計(jì)算底物Km 。

DPP1 細(xì)胞分析
該分析在 96孔板中進(jìn)行 (Corning Costar; Corning, Lowell, MA)。10 μL 分裝的化合物 (10-point half-log concentrations) 或 10 μL 5% (v/v) DMSO 陽性對照或 10 μL VS (final assay concentration [FAC], 10 μM) 陰性對照加到合適的孔中。隨后加入 30 μL 1.0 × 106/mL PBS重懸的 THP-1 細(xì)胞加到所有孔中。置于37°C 細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育60 min ,加入10 μL H-Gly-Phe-AFC (FAC 100 μM ~equivalent to Km) 開始反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物在熒光孔板讀數(shù)儀上讀數(shù)Spectramax Gemini (Molecular Devices, Sunnyvale, CA; Ex λ400 nm, Em λ505 nm)。在實(shí)驗(yàn)過程中,細(xì)胞活力要求降低程度<5%。化合物的pIC50用4參數(shù)logitic非線性擬合方程計(jì)算。標(biāo)用基于Michaelis-Menten的方程計(jì)算底物Km 。許多蛋白酶或溶酶體抑制劑,如bafilomycin A1, cystatin, elastase, cathepsin L, and cathepsin K都可以用來做THP-1細(xì)胞DPP1分析。作為對照,另外兩個(gè)底物(Gly-Arg)2-rhodamine 和 H-Gly-Arg-AMC可用上述方法在THP-1細(xì)胞中進(jìn)行,(Gly-Arg)2-rhodamine熒光檢測條件為Ex λ485 nm and Em λ535 nm。

用H-Gly-Phe-AFC在THP-1細(xì)胞中進(jìn)行DPP1成像
該分析在 96-well Biocoat collagen type 1 板中進(jìn)行(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)。在100μL的體系中,分析成分包括 10 μL H-Gly-Phe-AFC (FAC 100 μM), 10 μL of DraQ-5 dye (FAC 2 μM; Biostatus, Leicester, UK), 10 μL of DMSO (FAC 1% [v/v]), 70 μL PBS重懸的THP-1 (i.e., final 56K cells)。孔板置于 ImageXpress 5000a (MDS Analytical Technologies, Sunnyvale, CA)成像。用20× PF ELWC objective抓拍圖像。DraQ-5 作為細(xì)胞核marker 區(qū)別于熒光信號 H-Gly-Phe-AFC。 DraQ-5 使用λ700-75 nm 發(fā)射濾光片λ620-60 nm 激發(fā)λ660 nm long-pass (LP) 分色鏡成像。DraQ-5 曝光時(shí)間為 250 ms.。H-Gly-Phe-AFC成像用λ535-50 nm發(fā)射濾光片, λ360-40 nm 激發(fā),λ505 nm LP分光鏡,曝光時(shí)間為150 ms。H-Gly-Arg-AMC成像用類似條件抓拍。 Hoechst 33342 作為細(xì)胞核marker在下面的采集過程中是使用:發(fā)射濾光片λ460-50 nm,激發(fā)為λ360-40 nm, λ400 nm LP 濾光片, 曝光時(shí)間為50 ms. H-Gly-Arg-AMC 成像發(fā)射濾光片為λ620-60 nm,激發(fā)為λ570-20 nm, λ585 nm LP 分光鏡及100-ms 曝光時(shí)間。

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以流式珠為基礎(chǔ)的高通量多通路篩選小分子GTP酶抑制劑 http://www.artisky.cn/?p=144 Thu, 08 Nov 2012 03:33:16 +0000 http://yypharm.com/blog/?p=144 應(yīng)用:腫瘤
基本原理:
小GTP酶是細(xì)胞活性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子,并是人類疾病特別是腫瘤中應(yīng)用小分子抑制劑的新型治療靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)手冊描述了一個(gè)多通路的,以流式細(xì)胞珠為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)來鑒定并確認(rèn)小GTP酶的抑制劑或激活劑。六種不同的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)換酶標(biāo)記的小GTP酶被綁定在谷胱甘肽的珠子上,每個(gè)都貼上了不同紅色熒光強(qiáng)度的標(biāo)簽。隨后,含有不同GTP酶的珠子將和被試的化合物一同混合并加入384孔板中,被熒光標(biāo)記的GTP將被讀出。這種新型的多通路實(shí)驗(yàn)將有助于實(shí)驗(yàn)者篩選大約200,000種化合物,同時(shí)確認(rèn)多于1200種的陽性化合物,以便下一步采用6-8通路的實(shí)驗(yàn),進(jìn)行深入地劑量反應(yīng)的分析。當(dāng)假陽性及假陰性的化合物被去除后,少數(shù)幾個(gè)小分子家族的對抗GTP結(jié)合活性的化合物被鑒定出來。

方法:
試劑及細(xì)胞系:
BODIPY-FL-GTP 2′-(or-3′)-O-(N-(2-aminoethyl) 尿烷,G-12411,延長的金抗褪色試劑從Invitrogen分子探針公司購買(Eugene, OR)。比色的G-LISA實(shí)驗(yàn)試劑盒用來定量Rac1/2/3的活性,羅丹明,鬼筆環(huán)肽,抗Rac1的單克隆抗體,谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)換酶標(biāo)記的GTP酶(包括:野生型的Cdc42, Rac1, RhoA, H-Ras及其活性突變體Cdc42Q61L, Rac1Q61L, RhoAQ63L, H-RasG12V)從Cytoskeleton, Inc. (Denver, CO)公司購買。GST-Rab2, GST-Rab7已經(jīng)純化,Mouse TruBlort? Ultra:鼠抗IgG的辣根過氧化物酶從eBioscience, Inc. (San Diego, CA)公司購買。Rac抑制劑NSC23766從Tocris Bioscience (Ellisville, MO)公司購買,EHT1864由A. Kornienko博士(New Mexico Institute of Mining & Technology)提供。多通路實(shí)驗(yàn)的珠子是由Duke Scientific Corp. (Fremont, CA)公司合成的,但現(xiàn)在也可通過Thermo Fisher公司訂購。其它的試劑均可從Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)購買。鼠啫堿性的白血病2H3 (RBL) 細(xì)胞,Swiss 3T3細(xì)胞及IgE抗體是由B. Wilson (University New Mexico)博士提供。

多通路初篩
為了多重分析微量GTP酶, 我們采用了7種不同程度紅色的直徑4微米谷胱甘肽珠。每個(gè)聚苯乙烯玻璃粉裝置規(guī)格為1.4 × 105 beads/μL ,每個(gè)玻璃粉大約1.2 × 106個(gè)谷胱甘肽單位(用綠色熒光蛋白)。準(zhǔn)備蛋白結(jié)合時(shí),240-250μL 的每個(gè)玻璃粉裝置被各自密封,在0.1%的牛血清白蛋白NP-HPS 緩沖液(0.01%體積比的NP-40, 30 mM HEPES pH 7.5, 100 mM KCl, 20 mM NaCl)中并含有1 mM EDTA (NP-HPSE),室溫下放置30分鐘。離心分離后收集玻璃粉裝置,在100μL NP-HPSE 中重懸浮,然后分別用1 μM 已配好的GST-GTPase(Rab2 wt, Rab7 wt, Cdc42 wt, H-Ras wt, Rac1 wt, and Rac1Q61L mutant) 4度過夜培養(yǎng)。每個(gè)成對GTPase 玻璃粉用100μL 冰溫的NP-HPSE 緩沖液沖洗兩次,并補(bǔ)充0.1% BSA 和 1 mM dithiothreitol (DTT),然后冰浴保存在離心管中。把成對的GTPase 玻璃粉快速混合后,在每個(gè)健康的實(shí)驗(yàn)平板上裝入5微升該混合物,然后將0.1微升的檢測化合物(1 mM stock in DMSO)加入到各平板中,在把5 μL BODIPY-FL-GTP (200 nM stock in NP-HPSE)加入到各平板中后,最后的化合物濃度達(dá)到10μM 和1%DMSO 。陽性對照包含了珠混合物,0.1微升DMSO,和熒光GTP, 放在每個(gè)平板的1 號和2號,陰性對照包含了玻璃粉混合物和熒光GTP,0.5mM無標(biāo)記的GTP作為競爭,還有1%DMOSO, 都被單獨(dú)分析。用100 nM BODIPY-FL-GTP來演示這個(gè)實(shí)驗(yàn),是有一個(gè)Kd范圍在10到30nM的G蛋白.因?yàn)樵?到10倍Kd下,演示實(shí)驗(yàn),當(dāng)1小分子濃度在10 μM時(shí)可以注意到50%的抑制,這就是3到10 倍Kd 的價(jià)值。在Z的價(jià)值的基礎(chǔ)上,20%的最低限度的抑制力可以用2-6M范圍內(nèi)Kd值檢測出來盤子(玻璃板)放在旋轉(zhuǎn)器上在4攝氏度的情況下溫育40-45分鐘。樣品分析是用如之前描述的大流量細(xì)胞計(jì)數(shù)來做的。細(xì)胞計(jì)數(shù)的量少量散射(分散)而且以530 ± 20 nm (FL1) and 665 ± 10 nm (FL8)及665 ± 10 nm (FL8)發(fā)射熒光,被收集到青二氫磷酸氨的細(xì)胞計(jì)數(shù)的流量上(Beckman Coulter, Fullerton, CA)384個(gè)好盤子的篩檢需要花費(fèi)15分,完全的文庫篩檢可以在8周內(nèi)完成。用IDLQuery軟件決定化合物在小孔的活性,結(jié)果按時(shí)間數(shù)據(jù)來分析。以FS和SS為基礎(chǔ)的參數(shù)被使用于識別單線態(tài)珠的數(shù)量。以FL8排放為基礎(chǔ),區(qū)別于涂有不同蛋白質(zhì)的珠子,而且計(jì)算每個(gè)珠子的中值熒光。如果在活躍時(shí)改變較大,然后20%來自于基線,則次化合物被稱作蛋白激活分子。基準(zhǔn)線被定在以100%測量值為基礎(chǔ),測量值來自于包含正調(diào)控的1%DMSO,在數(shù)據(jù)庫做進(jìn)一步描述。

劑量反應(yīng)的測量值
在初篩上經(jīng)進(jìn)一步分析鑒定,待測化合物是從混合存儲板中擇優(yōu)挑選出來的,然后從10mM的初始濃度連續(xù)的按1:3稀釋8次,產(chǎn)生9點(diǎn)稀釋階梯。本實(shí)驗(yàn)最終的濃度范圍從10nM到100μM。如前所述,小珠在復(fù)用初篩部分被涂上一層蛋白質(zhì)。我們可以使用1 多倍儀來進(jìn)行劑量反應(yīng)分析(Rab7 wt, Rab2 wt, H-Ras wt, H-RasG12V, Cdc42 wt, and Cdc42Q61L)和3 單一鏡像。(Rac1 wt, Rac1Q61L, and GST-GFP)。在包含鎂的實(shí)驗(yàn)中,我們使用含1mM的MgCl2 NP-HPS緩沖器。8 GST-GTPases在一個(gè)單一多倍儀(Rac1 wt, Rac1Q61L, Rac2 wt, RhoA wt and RhoAL63, Cdc42 wt, Cdc42Q61L and Ral wt)中同時(shí)被鑒定,而且100nM BODIPY-FL-GTP粘合物在存在或缺少一系列藥物稀釋系列中被測量。每個(gè)劑量反應(yīng)系列被一分為三。

動力學(xué)分析
野生型GST-Cdc42 (4 μM)在4°C下被束縛在GSH-beads一夜。在30°C下20 分鐘,包含緩沖器的10 mM EDTA,在GSH-beads上的 Cdc42被核苷酸耗盡,用NP-HPS緩沖液洗兩次,然后懸浮在含有1 mM EDTA, 1 mM DTT, and 0.1% BSA的同樣的緩沖液中。動力學(xué)分析顯示,用DMSO (1%最終濃度)或者10 μM MLS000532223孵化50μL的GST-Cdc42-GSH-bead懸浮液2分鐘,隨后添加50 μL的冰冷的各種濃度的 BODIPY-FL-GTP。在動力學(xué)模式下,使用FacSCAN流動細(xì)胞計(jì)數(shù)器測量聯(lián)合熒光核苷酸。此項(xiàng)目平均數(shù)是150per s。使用IDLQuery(免費(fèi)從作者那獲得軟件)將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成ASCII格式。使用GraphPad Prism軟件輸出策劃未加工的數(shù)據(jù)。

Rac激活實(shí)驗(yàn)
在細(xì)胞基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中,Swiss 3T3細(xì)胞總是通過MLS000532223來監(jiān)控Rac1抑制。細(xì)胞一晚血清餓死,然后用1% DMSO(負(fù)調(diào)控)或在10 μM DMSO(1%最終濃度)化合物處理20到30分鐘。當(dāng)正調(diào)控時(shí),用10 ng/mL表皮生長因素(EGF)處理2分鐘。細(xì)胞溶菌作用,免疫沉淀反應(yīng)的積極Rac1,用GST-PAK-PBD固化在GSH珠,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),如上所述免疫印跡。

活化Rac的G-LISA?實(shí)驗(yàn)
按照標(biāo)準(zhǔn)流程對Swiss 3T3細(xì)胞進(jìn)行饑餓培養(yǎng)(Cytoskeleton, Inc., Denver, CO)。在6-well dishes的個(gè)體培養(yǎng)用濃度范圍在0.1到10μM的MLS000532223孵化一個(gè)小時(shí),隨后用10 ng/mL EGF刺激2分鐘。細(xì)胞用冰冷的PBS沖洗,PBS包含鈣,鎂和深層加工的蛋白質(zhì)和G-LISA?實(shí)驗(yàn)。正調(diào)控包括工具箱提供的Rac1-GTP和細(xì)胞溶解產(chǎn)物,由只用EGF控制刺激的細(xì)胞制備。

活細(xì)胞顯微鏡
活細(xì)胞顯微鏡用來觀察RBL-2H3 細(xì)胞。細(xì)胞在蓋玻片上生長一夜,用Tyrode緩沖液清洗,覆蓋(10 mM HEPES [pH 7.4], 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.4 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5.6 mM glucose, and 0.1% BSA)。在37°C下在100分鐘內(nèi)每隔60秒加入10 μM MLS000532223(最終濃度)后,拍攝時(shí)滯圖片。配合基刺激中,用1 μg/mL 2,4-二硝基酚 (DNP)–BSA。用Bio-Rad 輻射2100聚焦顯微鏡,裝備有一個(gè)60 × 1.4 NA油浸物鏡,物鏡配備有 lasersharp3000軟件。

熒光免疫檢驗(yàn)法著色和顯微鏡
RBL-2H3細(xì)胞在載玻片上生長和培養(yǎng)一夜,在10 μM MLS000532223存在或者缺少情況下。當(dāng)正調(diào)控時(shí),如前所述細(xì)胞被1 μg/mL DNP-BSA刺激30分鐘。細(xì)胞用PBS清洗,用3% 的多聚甲醛固定,用0.1%的Triton X-100在Tyrode緩沖液中透化五分鐘,用1% BSA在Tyrode緩沖液中阻礙一小時(shí),然后再用若丹明-鬼筆環(huán)肽染色一小時(shí)。所有的繁殖均在室溫下。在成像來看,使用Prolong gold anitifade 試劑使樣品在載物玻片上增加。一個(gè)A Zeiss LSM 510 顯微鏡,40×的物鏡,被用于收集圖像。

β-己糖胺酶分泌物測量
為了檢測β-己糖胺酶的釋放量,細(xì)胞用免疫球蛋白E包被在24孔板中隔夜培養(yǎng)。IgE培養(yǎng)的細(xì)胞在臺式緩沖液中用已經(jīng)濃度的抑制劑沖洗和培養(yǎng)一個(gè)小時(shí),等份試樣(100μL)的細(xì)胞培養(yǎng)上清液用來分析自然釋放的X的量。 將細(xì)胞暴露在1 μg/mL DNP-BSA的臺式緩沖液中, 37度處理30min, 使細(xì)胞活化。β-己糖胺酶的釋放量如 Ortega等人的描述的方法進(jìn)行計(jì)算。其值根據(jù)采用的1% Triton X-100的臺式緩沖液的不同,計(jì)算總量中β-己糖胺酶的百分比。

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一個(gè)強(qiáng)大的高通量篩選胚胎腫瘤細(xì)胞的分化和生存的化學(xué)調(diào)制 http://www.artisky.cn/?p=142 Thu, 08 Nov 2012 03:30:52 +0000 http://yypharm.com/blog/?p=142 應(yīng)用:癌癥(癌癥干細(xì)胞抑制劑/分化劑)和神經(jīng)學(xué)/組織再生(干細(xì)胞生存誘導(dǎo))

原理:
理清管理干細(xì)胞的自我更新,分化或死亡的命運(yùn)選擇的復(fù)雜的相互作用,向科研人員提出了一個(gè)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。以圖像為基礎(chǔ)的現(xiàn)象驅(qū)動的篩選通過提供快速的多個(gè)小分子同時(shí)被檢測的手段而符合這種挑戰(zhàn)。在這種篩選中,多能的胚胎癌(EC)細(xì)胞提供了一個(gè)方便的胚胎干細(xì)胞(ES)替代品,因?yàn)樗鼈冎恍枰唵蔚木S護(hù)和控制。作者開發(fā)了一種基于圖像的篩選試驗(yàn),通過測量細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞表達(dá)一個(gè)多能性相關(guān)的標(biāo)記SSEA3的比例的效果,以確定能影響人類EC干細(xì)胞株NTERA2的生存或分化的化合物. 80個(gè)激酶抑制劑的試點(diǎn)篩選確定了幾個(gè)改善細(xì)胞的生存或誘導(dǎo)分化的化合物。這些生存化合物能強(qiáng)烈抑制這些激酶的ROCK和PRK2. 突出了這些激酶在EC細(xì)胞的存活中的重要作用。故而猜測這些抑制劑可能在組織再生和神經(jīng)系統(tǒng)中是重要的工具。兩個(gè)其他的分子,GF109203X和rottlerin,誘導(dǎo)EC的分化和抑制ES細(xì)胞的自我更新能力,導(dǎo)致細(xì)胞周期停止,壓抑多能性相關(guān)基因的表達(dá)。這些分子可能是強(qiáng)有力的癌癥干細(xì)胞抑制體的前體。

方法:

胚胎癌和胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)
NTERA2 cells3如同以前所述的保存在杜爾貝科的改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)液; Invitrogen公司,佩斯利,英國),輔以10%小牛血清(FCS;
胎牛血清,ThermoScientific,Cramlington,英國)在37°C及含10%二氧化碳的空氣中. 3種人類胚胎干細(xì)胞系(ES)被用于這項(xiàng)研究. 它們是shef4,Shef5,Shef6,10和H7.1 所有的ES細(xì)胞都被保持以集落形式在不能分裂的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞上(MEFs). 細(xì)胞培養(yǎng)在含有KnockOut
DMEM培養(yǎng)液(KO-DMEM; Invitrogen), 輔以20%的KnockOut血漿置換(Invitrogen),1mM L-谷氨酰胺(Invitrogen公司),0.1mMβ-巰基乙醇(Sigma-Aldrich公司,普爾,多塞特,英國),1×非必需的氨基酸(Invitrogen公司),和4 ng / mL的基本成纖維細(xì)胞生長因子(FGF; Invitrogen公司), 并置于37℃,含5%的二氧化碳空氣中。

化合物:
用于主要篩選的化合物庫是蛋白激酶抑制劑庫(生物分子,恩佐生命科學(xué),
英國埃克塞特; http://www.biomol.com)。全反式維甲酸和DMSO購自
Sigma-Aldrich公司。

抗體
以下的主要單克隆抗體是從預(yù)先滴定的雜交瘤的上清液在自己的實(shí)驗(yàn)室制備的:
MC631(anti-SSEA3), 11 MC813-70(anti-SSEA4),12 TRA-1-60,13和
P3X63Ag8.14兔多克隆抗OCT4(ab19857-100; Lot no. 138154)抗體購自Abcam(劍橋,英國)。使用的次要抗體是Dylight-594-結(jié)合的山羊抗大白鼠IgM抗體,μ鏈特異性抗體(112-515-075; Lot no. 82183; Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA), 熒光素結(jié)合的山羊抗小白鼠IgG(115-095-003;批號52637;Jackson ImmunoResearch),或Dylight-488-結(jié)合的驢抗兔IgG抗體(711-485-152;Lot no.88371;Jackson, ImmunoResearch)作為適當(dāng)?shù)闹饕贵w的亞型.
主要和次要的篩選試驗(yàn)
為篩選化合物,NTERA2細(xì)胞接種在96孔μclear平底板,每孔2500
細(xì)胞(格雷納Bio-one,斯通豪斯,英國)。每個(gè)化合物進(jìn)行了三種不同濃度(0.1,1和10μM)的測試,而且是每種濃度一式三份.
井。每個(gè)平板中有9個(gè)孔含有0.1%DMSO(載體)作為對照,3孔含10微摩爾全反式維甲酸作為分化對照。5天后,細(xì)胞用無Ca2 +和Mg2 +的
Dulbecco的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗一次,然后用4%多聚甲醛固定
15分鐘。隨后是洗滌細(xì)胞并在加有10%FCS(封閉液)的PBS中封閉
1小時(shí)。細(xì)胞然后與主要抗體SSEA3 在一起培養(yǎng)1小時(shí).之后用PBS洗三次,并在一種與FIT C結(jié)合的第二抗體中孵育1小時(shí)。平板上至少有三個(gè)
孔的細(xì)胞僅僅與第二抗體在一起培養(yǎng)過.以此確定背景熒光。細(xì)胞核用10微克/毫升赫斯特33342(Invitrogen公司)進(jìn)行復(fù)染色。染色細(xì)胞的圖像
使用自動顯微鏡平臺而獲得(InCell分析1000年,GE醫(yī)療,小Chalfont
英國)。使用10×目鏡從每孔獲得10個(gè)隨機(jī)視野。使用開發(fā)工具箱1.7軟件(GE醫(yī)療)對圖像進(jìn)行分析。來于主要篩選中的點(diǎn)擊的效果用與主要篩選相同的程序重復(fù)試驗(yàn)化合物在0.1,1,2.5,5,10μM的最終濃度進(jìn)行證實(shí).
Z'因子評估
Z'因子是一個(gè)無量綱參數(shù)用來評估篩選試驗(yàn)成功與否/.15性能計(jì)算Z'因子,
在一個(gè)96孔的板中,30孔的細(xì)胞經(jīng)0.1%DMSO處理作為細(xì)胞分化的陰性對照..另30孔細(xì)胞用10μM的全反式維甲酸處理作為細(xì)胞分化的陽性對照。在SSEA3陽性細(xì)胞的比例按前面所述進(jìn)行確定。使用下列公式計(jì)算Z'因子
:1 - [(3 * SD(陰性對照)+3 * SD(陽性對照)/(平均值(陰性對照) - 平均值(陽性對照)]。

細(xì)胞生長的實(shí)驗(yàn)
對于EC和ES細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn),在rottlerin(0.3-10μM)存在,或有0.1%DMSO載體對照的情況下, NTERA2或Shef4分別以2500或6000個(gè)細(xì)胞種植于96孔平板的每孔. 經(jīng)過5天,細(xì)胞用PBS洗,并用4%多聚甲醛固定15分鐘。用PBS洗滌后,原子核是由10微克/毫升赫斯特33342(Invitrogen公司)染色而可視化和使用InCell Analyzer 1000(GE Healthcare)成像.
克隆形成實(shí)驗(yàn)
在涂有基底膜(Matrigel BD公司,牛津大學(xué),英國; KO-DMEM培養(yǎng)液1:25稀釋)的6孔板進(jìn)行檢測。 H7型細(xì)胞用0.1%DMSO(對照組)或5μM rottlerin進(jìn)行預(yù)處理24小時(shí),然后用胰蛋白酶處理后進(jìn)行收獲.
用培養(yǎng)液洗一次,使細(xì)胞重新懸浮在mTESR
培養(yǎng)液(StemCell Sciences,Palo Alto,CA),每孔分別種植10 000個(gè)細(xì)胞. 經(jīng)過7天,用4%多聚甲醛固定細(xì)胞. 染色用Hoechst 33342(Invitrogen公司)。通過InCell Analyzer1000(GE Healthcare)使平板成像.
使用Developer Toolbox(GE Healthcare)軟件從圖像進(jìn)行菌落數(shù)計(jì)算. 菌落形成效率用7天后菌落的數(shù)目和細(xì)胞種植的數(shù)目的比例來計(jì)算.
流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志
用胰蛋白酶(Invitrogen公司)分離細(xì)胞,并重新懸浮在封閉緩沖液(PBS輔以10%胎牛血清)。然后,5×105個(gè)細(xì)胞與一個(gè)主要抗體一起培養(yǎng)30分鐘。用封閉液洗滌三次后,細(xì)胞用與FITC結(jié)合的第二抗體標(biāo)記30分鐘。
隨后用封閉緩沖液洗滌細(xì)胞三次.,在CyAnADP氧氣流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter公司,布雷亞,CA)上分析細(xì)胞熒光。FITC陽性的標(biāo)準(zhǔn)是僅僅和第二抗體一起培養(yǎng)過的對照細(xì)胞或與來于母體骨髓瘤細(xì)胞系P3X63Ag8的陰性對照抗體一起培養(yǎng)過的細(xì)胞

BrdU細(xì)胞周期分析
5'-溴-2'-脫氧尿苷(尿嘧啶;Sigma-Aldrich)的結(jié)合被用來確定細(xì)胞增殖。 shef4細(xì)胞用不同濃度的rottlerin或0.1%DMSO(載體控制)處理24小時(shí)。然后這些細(xì)胞在20μM尿嘧啶中跳動2小時(shí),用PBS洗,之后用胰蛋白酶(Invitrogen公司)處理并收獲。 PBS洗滌后,細(xì)胞被固定在
70%的乙醇里,并儲存在-20°C過夜。用PBS洗滌細(xì)胞兩次,然后孵育在1.5毫升0.2毫克/毫升胃蛋白酶(Sigma-Aldrich公司)里45分鐘。隨后細(xì)胞用0.1 M的四硼酸鈉(Sigma-Aldrich公司)洗兩次,用PBS洗一次。細(xì)胞用抗BrdU抗體(Dako公司,Glostrup,丹麥)標(biāo)記45分鐘. 之后用PBS洗兩次,與FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG +M第二抗體(Invitrogen公司)在4C培養(yǎng)45分鐘。用加有1%胎牛血清的PBS洗滌3次后,細(xì)胞用
20μg/ mL的RNA酶A(Sigma-Aldrich公司)處理30分鐘,然后重懸于
在含1%胎牛血清和10μg/ mL的碘化碘(PI; Sigma-Aldrich公司)的PBS里。青色的ADP與氧氣光學(xué)儀的流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter)用于分析細(xì)胞的熒光。

Annexin V(膜聯(lián)蛋白質(zhì)V-FITC) 檢測細(xì)胞凋亡
shef6細(xì)胞生長在六孔板用0.1%DMSO(對照組),或者含有5微摩爾rottlerin,或10微摩爾rottlerin的完全培養(yǎng)液里。每種條件都用一式三份培養(yǎng)孔。在一個(gè)18 h的培養(yǎng)后,收獲分離的或貼壁的細(xì)胞,并集中從每個(gè)孔里收集到的細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)離心沉淀,用PBS洗一次,再用結(jié)合緩沖液(10 mM肝素鈉,140 mM氯化鈉,氯化鈣2.5毫米,pH值7.4)洗一次,然后在室溫下在黑暗中孵育在20μL膜聯(lián)蛋白V-FITC(Invitrogen公司)里20分鐘。碘化碘(PI;10微克/毫升; Sigma-Aldrich公司)添加到每一待測的樣本, 然后細(xì)胞熒光在CyAnADP O2流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter公司)測量。

PCR定量
根據(jù)制造商的指示,使用RNeasy Mini試劑盒(Qiagen公司,克勞利,英國)提取總RNA。然后根據(jù)制造商的說明,用SuperScript II逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen公司)從1微克RNA合成cDNA第一鏈。PCR定量是在含有1×SYBR綠色JumpStart Taq的準(zhǔn)備預(yù)混(Sigma-Aldrich公司)和4 pmoles的正向和反向引物的20μL的反應(yīng)中進(jìn)行。反應(yīng)在iCycler iQ上運(yùn)行(Bio-Rad公司,Hercules,CA)。每個(gè)樣品一式三份進(jìn)行了測試,
GAPDH的表達(dá)用于樣本的規(guī)范化。RT-PCR和qPCR引物序列是從發(fā)表的研究報(bào)告或用Primer3方案(http://frodo.wi.mit.edu/primer3)從目標(biāo)序列選定的。
用TaqMan低密度陣列卡實(shí)時(shí)定量分析:
為了評估m(xù)RNA的相對表達(dá)水平,使用了一個(gè)TaqMan人類干細(xì)胞多能性的陣列(TLDA)卡(Applied Biosystems公司,靈頓,英國)。根據(jù)制造商的指示, 使用高容量的cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Applied Biosystems公司), 使RNA被轉(zhuǎn)錄到cDNA. 在TLDA卡的每個(gè)端口上裝有含有1×的TaqMan通用預(yù)混(Applied Biosystems公司)和相應(yīng)于100 ng總RNA的cDNA的100μL的反應(yīng)盒。在相同TLDA卡上, 每個(gè)樣品進(jìn)行了一次重復(fù)測試。用ABI 7900(Applied Biosystems公司)采用熱循環(huán)。基因表達(dá)的相對定量用ΔΔCTmethod計(jì)算. 16β-肌動蛋白被用來作為內(nèi)源性對照以使樣品正常化,載體對照樣品(0.1%二甲基亞砜)是為相對量化校準(zhǔn)的。如果基因擴(kuò)增的CT值> 36 (即表達(dá)水平很低), 則被排除在分析外。

定量細(xì)胞的三磷酸腺苷
根據(jù)制造商的指示, 使用ATP測定試劑盒(Invitrogen公司)對細(xì)胞中總?cè)姿嵯佘眨ˋTP)進(jìn)行量化。簡言之,Shef6胚胎干細(xì)胞與5μM的rottlerin,10μM的rottlerin,或0.1%二甲基亞砜一起孵育2小時(shí)。用胰蛋白酶在
37℃作用3分鐘以收獲細(xì)胞,在ES培養(yǎng)液中洗一次,用PBS洗兩次。細(xì)胞顆粒在0.1 M的NaOH / EDTA中在60°C,40分鐘被溶解。然后,200μL預(yù)熱至100°C的Tris-EDTA添加到細(xì)胞裂解液并煮開2分鐘。接下來,10μL細(xì)胞裂解液放置在一個(gè)96孔板的孔里,通過加入90μL熒光素酶溶液使反應(yīng)開始。光發(fā)射立即使用光學(xué)板閱讀儀(BioTek, potton,英國)進(jìn)行測量。根據(jù)制造商的指示, 使用BCA分析(ThermoScientific)測定蛋白質(zhì)的濃度, 以計(jì)算細(xì)胞數(shù)目在不同處理之間可能存在的差異.

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使用非洲蟾蜍提取物篩選Wnt-B-catenin 的信號通路的小分子抑制劑 http://www.artisky.cn/?p=140 Thu, 08 Nov 2012 03:26:19 +0000 http://yypharm.com/blog/?p=140 基本原理和流程圖:

Wnt 信號通路的異常活化已被證明是與多種人類疾病,最明顯的是癌癥, 相關(guān)聯(lián)的. 這一通路的抑制劑的篩選幾乎完全使用培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞. 眾所周知, 這可能會有人為的傾向及由于所用細(xì)胞株的基因背景而導(dǎo)致結(jié)果偏頗. 現(xiàn)在我們使用融合B-連環(huán)素和Axin 與螢火蟲及海腎熒光素酶, 實(shí)驗(yàn)分別表明融合的蛋白質(zhì)的表現(xiàn)類似于它們的野生型配對物. 使用這鐘雙熒光素酶的讀數(shù), 我們改用非洲蟾蜍提取物系統(tǒng)來進(jìn)行高通量篩選. 從這些結(jié)果表明信號分布曲線反應(yīng)出抗體庫篩選的復(fù)雜性. 憑借這些結(jié)果, 我們可以合理推測其它胚胎途徑, 癌癥的失控.及用非洲蟾蜍卵提取物改變篩選抑制物/調(diào)制物.
附加工具: 以非洲蟾蜍為基礎(chǔ)的篩選能作為一種獨(dú)立的佐證工具來驗(yàn)證從哺乳動物的篩選, 并獲得額外的信心.

方法:
化合物和重組蛋白
試劑– 3,6-二羥基,5,7-二羥黃酮, 兒茶素水合物, 放線菌酮均購自Sigma-Aldrich(圣路易斯, 密蘇里州). LRP6-ICD 象以前描述的那樣準(zhǔn)備,但有輕微的改變. 8 種細(xì)菌的沉淀物用6M鹽酸胍變性, 組氨酸標(biāo)記的LRP6-ICD 與鎳樹脂結(jié)合,然后用咪唑洗脫. 洗脫用透析方法去掉鹽酸胍. 所有的化學(xué)結(jié)構(gòu)用CS ChemDraw Ultra 的方法提取. 除非另有說明, 二甲基亞碸在所有的實(shí)驗(yàn)中用作所有化合物的載體.

在體外翻譯的蛋白質(zhì)
按照產(chǎn)商的指示, 放射性標(biāo)記的B-Catenin 和Axin生成于兔網(wǎng)織細(xì)胞裂解液(Promega 公司, 麥迪孫, 威斯康星州). 另外用于HTS的B-Catenin-FLuc 和 Axin-RLuc 亦根據(jù)產(chǎn)商的指示產(chǎn)生于TNT SP6高產(chǎn)蛋白表達(dá)系統(tǒng)(Promega).

非洲蟾蜍卵提取物的準(zhǔn)備:
所有的蟾蜍都在排卵前3-7天用100U 孕馬血清促性腺激素激活(孕馬血清,Sigma公司). 給予500U人類絨毛膜促性腺激素誘導(dǎo)排卵.然后,每一只蟾蜍放在一個(gè)裝有約2升的Marc’s 改良林格氏液(MMR)(100mMNaCl, 2mM KCl, 1mMMgCl2, 2mMCaCl2, 0.1mMEDTA, 5mMHEPES(pH7.8).的大箱內(nèi),并讓其在16C條件下排卵12-18小時(shí), 再把蟾蜍移至另外的容器.把蟾蜍卵集中到一個(gè)燒杯內(nèi),用16C的1XMMR液體洗三次以去除碎片.讓蛙卵沉淀,去除多余的緩沖液.然后溫柔旋轉(zhuǎn),使蛙卵重新懸浮在一個(gè)含有2%半胱氨酸的MMR液體里.膠樣外膜約5分鐘內(nèi)開始溶解,并且當(dāng)蛙卵完全沉淀在一起時(shí)完全溶解.用大量的1XMMR清洗蛙卵,直到緩沖液看上去不再混濁.蛙卵然后再用蟾蜍緩沖液(100 mM KCl, 0.1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM potassium HEPES(pH7.7),50 mM Sucrose)洗兩次.用大口塑料巴斯德吸量器把看上去是白色的蛙卵吸去因?yàn)檫@些細(xì)胞已死亡并可能汚染提取物.把蛙卵移到一個(gè)冷卻的30毫升離心管.當(dāng)卵子一沉淀就吸去多余的緩沖液.把這些蛙卵首先在SorvalRC-6里4度下用200rpm離心2分鐘以進(jìn)一步去除多余的緩沖液,4度下再用21,000g 粉碎性離心5分鐘以使提取物分離成三個(gè)主要層次.中間層含有細(xì)胞質(zhì).用一個(gè)p1000的塑料吸管頭通過在頂部脂質(zhì)層打一個(gè)孔把這一層吸出再放進(jìn)一個(gè)新鮮的,冷卻的30毫升的管子,加入細(xì)胞松弛素B(10微克/毫升)以防止肌動蛋白的聚合.提取物用21,000g離心,細(xì)胞質(zhì)被轉(zhuǎn)移兩次.最終的提取物應(yīng)該是淡黃色.蛋白酶抑制劑(1000X貯存濃度,亮肽素,靡酶抑素,和胃蛋白酶抑制劑都是10毫克/毫升于DMSO內(nèi)).能原組合(20mM三磷酸腺苷, 150 mM 磷酸肌酸 2 mM EGTA, 20 mM 含水MgCl2 (pH7.7))都被加入并混合,提取物被分裝,快速冷凍,儲藏在液氮里.這種提取物能保存B-Catenin 和Axin的降解活性一年以上.

384孔實(shí)驗(yàn)條件:
把先前準(zhǔn)備的提取物迅速解凍, 并置于冰上. 在體外翻譯(IVT)的B-Catenin-FLuc (1 毫升), Axin-RLuc (1.5毫升), LRP6ICD (400 nM) 被加入到100 毫升蛙卵提取物里, 并在4C下以從一端到另一端的轉(zhuǎn)動方式混合10 分鐘. 然后樣品由一個(gè)24 通道的重復(fù)吸量器人工地分進(jìn)冷卻的384孔板(5微升/孔)并保持在4C冷藏室內(nèi)直到需要加其它的化合物. 抗體庫化合物用針樣工具轉(zhuǎn)移進(jìn)去(自定義的儀器, 哈佛醫(yī)學(xué)院)或用Echo550隔音板重新摸式化(Labcyte, 范德比爾特化學(xué)生物研究所)平板,在 25C 和2%DMSO條件下, 達(dá)到最終濃度范圍在40到200uM., 然后板子被封好, 輕輕渦旋,在25C培育4小時(shí). 孵化后, 按照生產(chǎn)商提供的方法,用雙格洛熒光素酶檢測(Promega)螢火蟲和海腎熒光素酶活性. 在一個(gè)Envision平板閱讀儀(PerkinElmer, Waltham, MA)上或FDSS系統(tǒng)(Hamamatsu, Bridgewater, NJ)熒光信號被接受. 當(dāng)需要稀釋時(shí), 蛙卵提取物用蟾蜍緩沖液進(jìn)行稀釋.

篩選統(tǒng)計(jì)學(xué):
按照Malo等人的方法要點(diǎn),我們正常化每一個(gè)平板. 在正常化程序中, 使用杜克的中位數(shù)去除以刪除系統(tǒng)性的行和列的偏差(例如, 邊緣效應(yīng)). 找出Axin 和B-Catenin孔之間的正常化的板塊之間的不同(相當(dāng)于非板塊規(guī)模的比例).如果在兩個(gè)復(fù)制物中板塊的強(qiáng)度差異經(jīng)驗(yàn)分布在5 - 95%之中,這個(gè)化合物就被確定.
如用克魯斯卡爾-沃利斯分析,數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成Z-分?jǐn)?shù)(Z=\frac{x-\mu}{\sigma}), 并用閾值的Z-分?jǐn)?shù)(z <-3, z > 3, 及-3 < z > 3) 來分成三組(活化劑, 抑制劑, 和無活性化合物). 克魯斯卡爾-沃利斯分析的應(yīng)用表明: 在這三組中,總數(shù)的平均值有著明顯的差異(p=1.07e-19).

報(bào)告分析:
以細(xì)胞為基礎(chǔ)的熒光酶檢測, HEK293 STF 細(xì)胞在次級融合水平被接種到96孔板, 并用穩(wěn)定格洛熒光素酶檢測儀(Progema)進(jìn)行熒光酶活性測定.使用CellTiter-Glo 檢測儀(Promega)使熒光酶活性正常化到活細(xì)胞數(shù)量. 所有的圖表與非線性回歸都用Prism4(Graph Pad Software, 圣迭戈,加州)擬合成一個(gè)S型劑量反應(yīng)曲線(可變的曲線).

細(xì)胞株:
HEK293 和IEC-6購自ATCC. 用標(biāo)準(zhǔn)的方法生產(chǎn)的一個(gè)HEK293 細(xì)胞株可在CMV(CMV-Luc)啟動因子的控制下穩(wěn)定的表達(dá)螢火蟲熒光酶.
細(xì)胞株被保存在DMEM及10%胚胎牛血清和抗菌素里.
除非另有說明, 細(xì)胞株被用化合物/或Wnt處理24 小時(shí).

抗體和質(zhì)粒:
用Alpha-B- 連環(huán)蛋白(BD 轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室, 富蘭克林湖, 新澤西)和Alpha – 微管蛋白(圣克魯斯生物技術(shù), 圣克魯斯, 加州)抗體進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn). 以標(biāo)準(zhǔn)的PCR為基本的克隆方法并進(jìn)一步克隆進(jìn)pCS2載體產(chǎn)生B-Catenin-FLuc 和Axin-RLuc的融合,LRP6ICD 的細(xì)菌表達(dá)建立已在 8 描述過.

免疫印跡和免疫熒光:
免疫印跡– 細(xì)胞被溶解在非變性緩沖液(50mM Tris-Cl, pH7.4, 300mMNaCl, 5mMEDTA, 1%[w/v]Triton X-100). 可溶性的部份用于免疫印跡.
免疫熒光– 細(xì)胞被點(diǎn)在涂有纖維連接蛋白涂層的蓋玻片上, 用3,7%的甲醛固定, 染色, 放進(jìn)備有DAPI的VectaShield (媒介實(shí)驗(yàn)室). 用一個(gè)裝在尼康Eclipse 80i熒光顯微鏡上的CoolSNAP ES攝像機(jī)的60X或100X 的放大物鏡來拍攝圖像..

非州蟾蜍的研究:
非州蟾蜍在體外受精, 去膠樣外膜, 保存和注射如前所述. 化合物溶解在100%DMSO中. 測試復(fù)合物沐浴實(shí)驗(yàn): 胚胎被培養(yǎng)在MMR中,化合物按照指定的濃度加入.在第10期, 胚胎用大量的MMR 洗三次,以清除殘留的化合物. 按照生產(chǎn)商的說明, 用MESSAGE 機(jī)器, 一層層的B-Catenin FLuc 和 AxinRLuc mRNA就生成了.

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建立穩(wěn)定生產(chǎn)表達(dá)IGF-1R細(xì)胞株以供篩選抗IGF-1R單克隆抗體(mAB)或小分子酪氨酸激酶抑制劑所用 http://www.artisky.cn/?p=138 Thu, 08 Nov 2012 03:23:06 +0000 http://yypharm.com/blog/?p=138 該方法也適用于其它類型的致癌酪氨酸激酶(RTKS)受體

建立一個(gè)能誘導(dǎo)表達(dá)IGF-1R的 MEF細(xì)胞系株
克隆編碼IGF-1RcDNA 并在C-末端加2 myc6His標(biāo)簽,插入pTRE載體(Clontech 公司), 通過共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pSV Hygro 進(jìn)入tet-off MEF細(xì)胞株而建成. 用 200微克/毫升潮霉素(hygromycin)選擇被成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞.

用熒光激活細(xì)胞分選/Western/磷酸化酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)分析鑒定細(xì)胞株
用熒光激活細(xì)胞分選(FACS)/WESTERN/磷酸化的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測定時(shí), 將細(xì)胞置于有或無強(qiáng)力霉素的狀況下超過48小時(shí), 然后以每孔750,000個(gè)細(xì)胞的濃度接種于6個(gè)10 cm的培養(yǎng)皿里, 并繼續(xù)在有或無強(qiáng)力霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。接種后24小時(shí), 5 個(gè)培養(yǎng)皿用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次、然后把培養(yǎng)液換成含有0.1%FCS的DMEM。 再過第24小時(shí)后加入0, 5, 50, 100, 和 200 ng IGF-(13769,Sigma, Hamburg, 德國),這些細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。 次日, 去掉培養(yǎng)皿的上清液、用PBS 洗一次,把用胰酶消化的細(xì)胞與上清液混合在一起. 用離心的方法收集細(xì)胞并重新懸浮于500毫升PBS。取其中 250微升的細(xì)胞懸液、用甲醛固定, 用含有100微克/毫升核糖核酸酶H和25微克/毫升的碘染色PBS染色, 然后用FACSCalibur(流式細(xì)胞, 迪肯森,德國海德堡)進(jìn)行分析. 剩余的細(xì)胞離心沉淀,用緩沖液A(20 mM TRIS pH8/135mM NaCl/1%NP-40/10%甘油/1.5mM層酸鈉)外加一片整套蛋白酶抑制劑(Roche, 德國曼海門)的溶液裂解。 蛋白質(zhì)含量測定采用Bradford 方法. 裂解液用ELISA和Western blot方法分析。ELISA 分析: 100微克蛋白質(zhì)加到預(yù)涂有抗-myc(9E10)抗體的96孔板. Py-99抗體被用來檢測磷酸化的IGF-1R。Western-blot: 300 微克蛋白質(zhì)涂抹到硝酸纖維素膜用抗-myc(9E10),、抗-IGF-1R,、抗-AKT1 和磷酸-AKT 抗體(全是1:200)檢測。

軟瓊脂和免疫熒光檢測細(xì)胞
把細(xì)胞先培養(yǎng)在加有或無強(qiáng)力霉素的培基中至少48小時(shí)后,細(xì)胞才能進(jìn)行軟瓊脂以及IGF-1R免疫熒光檢測。
軟瓊脂檢測:
細(xì)胞被包埋在含有DMEMFCS 4%瓊脂糖里, 并保持原來加或不加強(qiáng)力霉素的狀態(tài)、接種到涂有0.8%瓊脂糖培養(yǎng)皿上.
免疫熒光分析:
細(xì)胞被放在蓋玻片下, 用4%多聚甲醛固定并使細(xì)胞通、 再用9E10抗體為第一抗體及用FITC標(biāo)記的抗鼠抗體為第二抗體進(jìn)行檢測、 隨后用DAPI復(fù)染細(xì)胞核。

細(xì)胞磷酸化檢測:
細(xì)胞先在有或無強(qiáng)力霉素培基中至少培養(yǎng)48小時(shí),然后被接種到48孔板里。 在無血清饑餓18小時(shí)后, 加入經(jīng)二甲基亞砜連續(xù)稀釋后的化合物 (二甲基亞砜的最終濃度為1%),培養(yǎng)90分鐘、隨后加入IGF-1作用10分鐘。 然后,細(xì)胞被裂解,如同以上描述的進(jìn)行ELISA檢測。 顯示出最有力抑制IGF-1R磷酸化及其下游效應(yīng)物AKT磷酸化的化合物,將被選為最有前景的先導(dǎo)化合物。

體內(nèi)移植瘤活性的研究:
用29G針頭的注射器注射,在左側(cè)腹背部的皮下組織里注射0.2毫升含有4X107細(xì)胞。原發(fā)腫瘤的體積用肉眼檢查, 通過游離卡尺測量大小并乘以所有立體面的距離. 當(dāng)原發(fā)腫瘤的體積達(dá)到約200立方厘米后, 開始用化合物/抗體治療或用強(qiáng)力霉素 (在含有1%蔗糖的飲用水里放2毫克/毫升)。在研究過程中, 動物的體重每周稱三次、每天監(jiān)測動物的行為。 評價(jià)IGF-1R抗體抗腫瘤的活性的標(biāo)準(zhǔn)是腫瘤的消退.
完全消退(CR)—腫瘤消退到小于觸診的最低限度(<63毫米)
部分消退(PR)—腫瘤縮小超過50%(CR包括在PR內(nèi))
對于尿嘧啶標(biāo)記的部分,剖檢前24小時(shí),往動物的腹腔內(nèi)注射100-200微升含有10微克/毫升尿嘧啶的無菌1XDPBS (BD Pharmingen).

在MEF/IGF-1R 腫瘤樣本里IGF-1R蛋白質(zhì)的表達(dá):
把腫瘤切成小塊,在Qiagen研磨混合器MM301里, 混與冰冷的溶解緩沖劑(1%Triton-X-100, 100mMNaCl, 10mMtris-HCl(pH7.5), 1mMEDTA(pH8), 1mMEGTA(pH8), 1mMNaF, 20mMNa4P2O7, 1mMNa3VO4, 10%甘油,以及一片蛋白酶抑制劑. Roche 診斷, 曼海門,德國)。在4C進(jìn)行2小時(shí)培養(yǎng)后, 腫瘤裂解物在4C下以16000g離心15 分鐘. 把上清液吸到一個(gè)放在冰浴里的新的干凈的管子里. 按照制造商的指示, 用Bradford進(jìn)行總蛋白濃度的測定(BIO-RAD protein Assay). 這些腫瘤裂解物要儲存在-80C直到進(jìn)行測定. 在腫瘤裂解物里, IGF-1R表達(dá)及AKT磷酸化可使用市售的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)合, 按照廠商的說明進(jìn)行測定(Dy391;R&DSystems, LilleCEDEX, 法國).

免疫組化:
從單個(gè)冰冷腫瘤里準(zhǔn)備7微米冰凍切片, 并用4%甲醛固定.用酒精加3%H2O2固定內(nèi)源性的過氧化物酶. 外源性的和總的IGF-1R則用生物素酰化的9E10抗體及隨后的鏈霉親和素和辣根過氧化物酶(PO)接合的抗兔抗體進(jìn)行測定. TUNEL 和Brad U的染色則根據(jù)廠商的說明進(jìn)行(分別是 Roche, 及 BD Pharmingen).

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人類長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4 和5的高通量篩選試驗(yàn)的發(fā)展和驗(yàn)證 http://www.artisky.cn/?p=136 Thu, 08 Nov 2012 03:21:29 +0000 http://yypharm.com/blog/?p=136 應(yīng)用: 代謝性疾病

理由: 食物中的長鏈脂肪酸的跨細(xì)胞膜的吸收主要由脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(FATP)傳遞. 在人類和rodent動物體內(nèi)這種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有6個(gè)不同表達(dá)的亞型存在.為了方便對抗FATP亞型的藥物的開發(fā), 這個(gè)實(shí)驗(yàn)采用哺乳動物細(xì)胞系穩(wěn)定表達(dá)重組人類FATP 4 和5,并開發(fā)一種使用一個(gè)96孔熒光成像板閱讀儀(FLIPR)的高通量篩選(HTS)的檢測. LCFA吸收的信號對背景之比是在3-5倍之間. 兩種化合物產(chǎn)生對FATP 4的抑制, 其1/2最大抑制濃度(IC50)分別是0.21和0.63 uM, 并顯示選擇性超過FATP5約100倍. 從美國藥物收集庫篩選對抗FATP 5 的藥物觀察到約0.4% 的命中率. 兩種被證實(shí)的有效物是膽汁酸,其IC50 分別是2.4 和0.22 uM. 為增加產(chǎn)量,用分析HT發(fā)展了一種在一個(gè)384孔形式中的單一時(shí)間測定的方法, 其結(jié)果可與96孔板方式相比. 總之,基于細(xì)胞的FATP 4 和5 的熒光檢測適合于一個(gè)主要的藥物篩選, 而分化的細(xì)胞系可用于輔助藥物的篩選.

方法:
. Hs FATP 4 和5穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株和試劑:
人類胚胎腎(HEK)293 細(xì)胞株的建立能穩(wěn)定表達(dá)人類重組HsFATP1,4,和5已在以前描述過. 4種細(xì)胞培養(yǎng)基和補(bǔ)充物購自Gibco Invitrogen (Invitrogen, CarIsbad, CA); QBT 脂肪酸檢測盒從MDS 分析技術(shù)(原Molecular Device Co, Sunyvale, CA)購得; 鵝去氧膽酸, 油酸,棕捛油都購自Sigma-Aldrich(St.Louis, MO). 兩種FATP4抑制劑, j3 和 j5, 都是根據(jù)最進(jìn)發(fā)表的文章而合成. 美國藥物收集庫(USDC)由已知藥理的1040種化合物組成, 29 種化合物購于Microsouce (Gaylordsville, CT). 所有的化合物都溶解在濃度為10mM的二甲基亞砜中作為儲備溶液.
細(xì)胞培養(yǎng): hsFATP1, 4,或5的細(xì)胞及載體控制的HEK293細(xì)胞被接種于含有2250毫克/升D-葡萄糖, 維生素B6, 0.5 CaCl2, 輔以10% 胎牛血清(FBS)和100個(gè)單位的青霉素-100微克鏈霉素/毫升及加有1毫克/毫升G418 (基因選擇)的Dulbecco”s 改良Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM).細(xì)胞接種到有PDL涂層的,黑色壁,透明底部的微孔板(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). 當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80,000/孔時(shí)用96孔板方法, 或者在20,000/孔時(shí)用384孔板方式. 在接種后12-16 小時(shí),平板可用于測定.
3T3-L1 前脂肪細(xì)胞,(美國型培養(yǎng)物收集, 貨號CCL92-1), 按照發(fā)表的文章的方法分化細(xì)胞. 24,25細(xì)胞分化的測定通過在顯微鏡下目視脂滴的積累. 在進(jìn)行檢測之前12-16小時(shí),當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到100,000/孔時(shí)接種到96孔平板.

QBT kit和熒光強(qiáng)度測量
QBT混合物按夾在產(chǎn)品中的指示(R8133,MDS Analytical Technologies)進(jìn)行準(zhǔn)備并包括專有的抑制劑和2uM熒光標(biāo)記的脂肪酸腎上腺素-FA。細(xì)胞防滲抑制劑有效抑制在溶液中腎上腺素-FA熒光。細(xì)胞吸收了腎上腺素-FA,細(xì)胞內(nèi)的熒光測定采用自下而上閱讀探測器FLIPR或分析師HT(兩種都來自MDS分析技術(shù))。所有合成的小分子溶解在DMSO作為儲備溶液,然后稀釋用1×充填緩沖液(1×漢克氏平衡鹽溶液加有20mM的HEPES緩沖液和0.2%無脂肪酸牛血清白蛋白[BSA])。在96孔板方式中做動力測定, 平板中的培養(yǎng)基用150微升1×充填緩沖液加50微升稀釋的濃度在5×的化合物(或175微升1×充填緩沖液加25微升稀釋的濃度在10×的化合物)在37°C在5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)30分鐘。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí),加入50微升的QBT混合物到培養(yǎng)孔. 為檢查脂肪酸衍生物的抑制效應(yīng),我們把培養(yǎng)的混合物溶解在乙醇里作為儲備溶液, 然后用1×充填緩沖液稀釋。在4C下. 在添加到培養(yǎng)平板做吸收測定之前,這個(gè)稀釋物用QBT混合物進(jìn)行平衡24小時(shí)。在把QBT混合物加入到細(xì)胞后,立即用FLIPR進(jìn)行熒光讀數(shù). 室溫下FLIPR的激發(fā)過濾器波長λex=488納米,而排放過濾器的發(fā)射波長= 540 nm。在384孔的格式中, 用單一時(shí)間點(diǎn)檢測的方法, 培養(yǎng)基要換成35微升1×充填緩沖液加5微升10×濃度的稀釋化合物
在5%CO2培養(yǎng)箱在37℃培養(yǎng)30分鐘. 在培養(yǎng)結(jié)束時(shí),10微升QBT混合物添加到培養(yǎng)孔. 然后, 隨著染料的培養(yǎng), 在1分鐘,1小時(shí),每孔的熒光密度用分析師 HT進(jìn)行測量, 在室溫下其發(fā)射過濾器波長λex=488納米,排放過濾器的波長=540納米。以雙盲的方式進(jìn)行先導(dǎo)藥物篩選.有效者仍用密碼直到完成濃度反應(yīng)試驗(yàn)的證實(shí)再解碼.

數(shù)據(jù)分析:

動力學(xué)分析,用FLIPR連續(xù)觀察吸收腎上腺素-FA 1小時(shí). 每孔的相對熒光
單位(RFU)的水平通過減去在第一數(shù)據(jù)點(diǎn)的熒光水平. 在1小時(shí)的觀察后終端點(diǎn)的相對熒光單位(RFU),作為最大的脂肪酸攝取量.在384孔格式的單一時(shí)間點(diǎn)檢測, 每孔的絕對熒光強(qiáng)度作為最大的脂肪酸攝取量. 在主要的檢測方法開發(fā)中熒光信號的百分比變化(抑制或增強(qiáng))與實(shí)驗(yàn)對照組比較按照雙重測量的平均值計(jì)算.。因?yàn)槲覀儫o法測定培養(yǎng)孔中最后的游離脂肪酸濃度,抑制脂肪酸的效力是基于起始濃度的假設(shè),即在生長介質(zhì)中脂肪酸結(jié)合類似程度的的蛋白質(zhì)。同樣,小分子的藥效是根據(jù)他們所表現(xiàn)的摩爾濃度而估計(jì),因?yàn)槲覀儧]有確定其蛋白結(jié)合全貌。濃度反應(yīng)曲線建造,并能適合一個(gè)4個(gè)參數(shù)的S 型函數(shù)以產(chǎn)生最大半抑制濃度(IC50)。適當(dāng)?shù)那闆r下,數(shù)據(jù)代表平均值}SEM至少3 次測量。

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藥物新靶點(diǎn)和基于384孔板高通量篩選的最佳實(shí)驗(yàn)方案 http://www.artisky.cn/?p=134 Thu, 08 Nov 2012 03:05:46 +0000 http://yypharm.com/blog/?p=134 第一部分 基于shRNA的方法

質(zhì)粒構(gòu)建
構(gòu)建報(bào)告基因質(zhì)粒:luciferase(pGL3; Promega, Madison, WI, or Genbank U47295) 基因克隆到pLLB3-GW-Kan慢病毒載體,限制酶切位點(diǎn)為Xba1 和Nhe1。新的序列確認(rèn)無誤的命名為pLLB3-GW-KanpGL3。
病毒包裝
1、HEK293T細(xì)胞以7.8×105數(shù)量重懸于2ml無抗生素含10% FBS 接種至六孔板(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, or Fisher,Pittsburgh, PA),放置于37° C, 5% CO2培養(yǎng)箱,培養(yǎng)過夜。
2、取1.5ml滅菌EP管,加入1.5μg包裝混合質(zhì)粒和0.3μg表達(dá)質(zhì)粒以及282μl的無血清培養(yǎng)基,18 ul Fugene 6 (Roche, Basel, Switzerland)輕柔混勻,室溫孵育30min。
3、將DNA溶液和轉(zhuǎn)染試劑加入鋪板的293細(xì)胞中,37° C, 5% CO2培養(yǎng),過夜。
4、移除含有DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)基移除,代之以含10%FBS和1%青霉素-鏈霉素DMEM培基。培養(yǎng)過夜。
5、收集轉(zhuǎn)染后48h的細(xì)胞上清,更換為完全培基。
6、轉(zhuǎn)染后72h,收集細(xì)胞上清,與48h收集的上清混合。
7、用0.45um的聚二氟乙烯過濾器((Millipore, Billerica, MA))去除含病毒上清中的非貼壁細(xì)胞,分裝,凍存于-80°冰箱。

病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)
1、 SKOV3、A549、Hela、MDA-MB-231或Panc 4.03 細(xì)胞以 200,000/孔接種于六孔板。
2、24h后,用1.5ml 含8 ug/ml 聚凝胺(Sigma, St. Louis, MO)和10 mM HEPES (Gibco, Carlsbad,CA)的完全培基更換。加入190ul的含病毒上清,以2100 rpm (1000g)速度輕輕搖動細(xì)胞1.5h。
注意:病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的最適條件在不同的細(xì)胞系之間有差異。但由于luciferase報(bào)告基因的高表達(dá),此步優(yōu)化不是特別關(guān)鍵。在siRNA轉(zhuǎn)染前至少孵育3h(標(biāo)準(zhǔn)的是與病毒共孵育24h,但轉(zhuǎn)染前孵育3h即可)。
第二部分 基于siRNA 的方法

siRNA轉(zhuǎn)染
1、在384-well組織培養(yǎng)皿中將每份lipid反應(yīng)物與4ul的Opti-MEM-I混合。
2、在4ul Opti-MEM-I中加入206 nM siRNA,并與lipid反應(yīng)物混合,孵育30min。
(該體系中siRNA濃度為25nM,如果siRNA濃度需要調(diào)整,可以進(jìn)行稀釋。)
3、用磷酸鹽緩沖液沖洗luciferase-transduced細(xì)胞2次,胰酶消化,細(xì)胞計(jì)數(shù),種入384孔板中。
4、For a forward transfection, 將混合物加入25ul完全培基培養(yǎng)了24h的細(xì)胞中。
5、For a reverse transfection,將25ul細(xì)胞加入使用lipid自動分散裝置且包含有siRNA的混合培養(yǎng)物中,孵育72h。
注意:每個(gè)細(xì)胞系根據(jù)經(jīng)驗(yàn)檢測分析每個(gè)孔中2個(gè)細(xì)胞之間的密度。檢測luciferase活性使用Bright-Glo regent (Promega),檢測細(xì)胞存活能力使用Cell Titer Glo cell viability (Promega)。所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)必需經(jīng)過三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn),結(jié)果的平均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差必須反映在圖表上。

Control siRNA stocks:材料及訂購信息

A、Diluted Dharmacon stock siRNAs (GFP) (cat# P-002102-01-05)

靶序列(GFP) 5′-GCG ACG TAA ACG GCC ACA AGT TC-3′

B 、Dharmacon luciferase(pGL3)siRNAs

高度沉默子(cat# D-002050-01-05)靶序列5′-GAT TAT GTC CGG TTA TGT ATT-3′,

中間沉默子(cat# D-002050-02-20)靶序列5′-CTG AAT ACA AAT CAC AGA ATT-3′,

低沉默子?? (cat# D-002050-03-20)靶序列5′-TCC GGA AGC GAC CAA CGC CTT-3′。

C、甘油醛三磷酸脫氫酶(GAPDH)(cat# MQ-004253-01)

D、甲羥戊酸(二磷酸)脫羧酶(MVD) (cat# MQ-006748-00)

E、磷脂酰肌醇-4-激酶催化多肽 (PIK4CB) (cat# MQ-006777-02)

F、pGL2 luciferase (cat# D-001100-01-05)

進(jìn)行QPCR的siRNAs實(shí)驗(yàn)包括caspase-8 (cat# M-003466-04)和MKSTYX (cat# M-008031-01),Dharmacon SMART pools 和TNFRSF1A (cat# MQ-005197-00),而 YARS (cat# MQ-011498-00)以及 TRIB3 (cat# MQ-003754-01) 則作為獨(dú)立的Dharmacon siRNAs。

 

第三部分? 質(zhì)量控制

實(shí)時(shí)熒光定量PCR

1、兩孔分別轉(zhuǎn)染siRNA之后,用RNeasy96試劑盒(Qiagen, Venlo, the Netherlands)抽提mRNA。

2、DNAse 1預(yù)處理兩次,每次15分鐘。

3、用High Capacity cDNA Archive試劑盒(Applied Biosystems, Foster City, CA)合成cDNA,其中引物為oligo dT25 (Sigma Genosys)、緩沖液中含有MgCl2 (Ambion, Foster City,CA)。

cDNA合成體系

成分 體積 ul
10x緩沖液 10
1 M MgCl2 0.55
100 mM dNTPs 4
20 U/ul RNasIn 1
50 U/ul Multiscribe 5
雙蒸水 12.45
RNA 67
合計(jì):100

 

4、在Applied Biosystems 7900HT系統(tǒng)上,以SYBR? Green為染料,擴(kuò)增下列引物(Sigma),定量檢測cDNA

① caspase-8 (NM_001228)

GGTCACTTGAACCTTGGGAA GAACTTGAGGGAGGCCAGAT
堿基:203到328,跨越229位32347 bp的內(nèi)含子

 

②MKSTYX (NM_016086)

ACATCCTGAAAGGGGGCTAT GCACGATTTCAATGGGGTAT
堿基:716到836,跨越795位8333 bp的內(nèi)含子

 

③TNFRSF1A (NM_001065)

GCTTCAGAAAACCACCTCAGACA ATGCCGGTACTGGTTCTTCCT
堿基:551到662

 

④YARS (NM_003680)

GCCCTGAAGAGAAACTGCAC GGGCACAAAGTAAGCCACAT
堿基:804到953,跨越845位6128 bp的內(nèi)含子

 

⑤TRIB3 (NM_021158)

TCAAGCTGTGTCGCTTTGTC CTTGTCCCACAGGGAATCAT
堿基:1053到1163,跨越1090位4616 bp的內(nèi)含子

 

不同細(xì)胞系的推薦接種密度(針對細(xì)胞生長分析)

表1 、384孔板每孔接種細(xì)胞密度(低/高)

表2、 384孔板轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化

 

???????? 細(xì)胞系?????????????????????????????????? 384孔
???????? Hela???? ????????????????????????????????750/1500
???????? Hek293?????????????????????????????????? 2500/5000
???????? SKOV3??????????????????????????????????? 750/1500
???????? A549???????????????????????????????????? 750/1500
???????? HCT116????????????????? ?????????????????1000/2000
???????? Huh7???????????????????????????????????? 1000/2000
???????? A673???????????????????????????????????? 2500/5000
???????? XMD5???????????????????????????????????? 750/1500
???????? UMR????????????????????????????????? ????750/1500
???????? MDA-MB-231?????????????????????????????? 750/1500
????? ???Panc 4.03??????????????????????????????? 750/1500
?細(xì)胞系??????????? 細(xì)胞數(shù)/孔????????? 轉(zhuǎn)染試劑???????? 試劑體積/孔
? Hela????????????? 750/1500???????? Dharmafect4????????? 0.07
? Hek293??????????? 2500/5000??????? Dharmafect4????????? 0.07
?SKOV3???????????? 750/1500???????? Dharmafect2????????? 0.03
?A549????????????? 750/1500???????? Dharmafect1????????? 0.07
? HCT116??????????? 1000/2000??????? Dharmafect3????????? 0.07
? Huh7????????????? 1000/2000??????? Lipofectamine2000??? 0.03
?A673????????????? 2500/5000??????? Dharmafect3????????? 0.03
??XMD5????????????? 750/1500???????? Dharmafect1????????? 0.07
? UMR?????????????? 750/1500???????? Dharmafect1????????? 0.03
?MDA-MB-231??????? 750/1500???????? Dharmafect4????????? 0.03?????????

 

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新型E3泛素連接酶抑制劑高通量篩選試驗(yàn) http://www.artisky.cn/?p=132 Thu, 08 Nov 2012 03:02:12 +0000 http://yypharm.com/blog/?p=132 應(yīng)用:腫瘤
基本原理
泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在多種細(xì)胞事件的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用,其失調(diào)可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生,尤其是腫瘤的發(fā)生。硼替佐米/萬珂為蛋白酶抑制劑,已被批準(zhǔn)用于治療多發(fā)性骨髓瘤。E3泛素連接酶與經(jīng)典的E1、E2酶功能一致,募集特定的底物,并協(xié)調(diào)其泛素化狀態(tài)以及隨后的蛋白酶降解或細(xì)胞活性改變。E3連接酶與包括腫瘤在內(nèi)的一系列病癥相關(guān),因此,在藥物開發(fā)中快速經(jīng)濟(jì)地檢測其活性是十分可取的。適用于E3連接酶的高通量篩選試驗(yàn)的相對缺乏已大大阻礙了E3的抑制劑的開發(fā),并減緩了這個(gè)關(guān)鍵領(lǐng)域的藥物研究。該方法描述了一種新型適用于E3連接酶試驗(yàn)的平臺,該平臺利用了泛素鏈中泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的固有親和力的優(yōu)勢,允許對E3連接酶依賴的泛素鏈形成的分析。該方法已成功應(yīng)用于RING和HECT家族,表明該平臺在分析E3連接酶時(shí)的廣泛應(yīng)用。

方法、材料
除非另有說明,所有試劑均購自Sigma公司(圣路易斯,密蘇里州),且所有試劑級至少為試劑級或更好。質(zhì)粒編碼Ube1,MuRF1 ,Hrd1的cDNA購自O(shè)pen Biosystems公司(漢茨維爾,AL )。
克隆和蛋白表達(dá):

表達(dá)SUMO化UBA2酶,包括Rad23 (殘基351-398), 僅K48泛素化 (K6R, K11R, K27R, K29R, K33R, and K63R), 6His-Ube1, 6His-UbcH5b, 6His-UbcH5c, 6His-UbcH7, SUMO-CARP2, SUMO-CARP2 (H333A), SUMO-MuRF1, 6His-E6AP和 SUMO-Hrd1 (殘基235-617),的大腸桿菌BL21 (DE3)的克隆、表達(dá)、純化均按標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)操作,并且使用SUMOpro融合載體( LifeSensors公司,賓州,Malvern)。所有構(gòu)建的結(jié)構(gòu)均完全測序,以驗(yàn)證其野生型序列或檢查引入的點(diǎn)突變。

E3連接酶的UBA自動泛素化實(shí)驗(yàn)

96孔中等結(jié)合板(賽默飛世爾科技,羅克福德,IL )在洗滌及3%牛血清白蛋白阻斷之前,用純化的SUMO化UBA2酶孵育。SUMO化UBA2酶通過疏水相互作用被動吸附從而被非特異固定。在一個(gè)典型的檢測,每孔由不同濃度的E3連接酶與5nM Ube1、100nM E2和1.1 μM K48泛素化一起構(gòu)成的50μL反應(yīng)緩沖液( 50mM Tris-HCl [pH值8.0], 5mM MgCl2,0.2mM ATP,1 mM β-巰基乙醇)孵育。室溫孵育一段固定時(shí)間(在最初的線性范圍內(nèi))后,用洗板器(BioTek, Winooski, VT)0.1%PBST洗3遍。5%牛血清白蛋白/PBST稀釋的抗泛素兔抗(稀釋度 1:50)(Sigma)及FITC/HRP標(biāo)記的兔二抗(稀釋度 1:10,000)(ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)連續(xù)孵育1小時(shí),且每次孵育后用PBST洗板。所有散裝試劑的稱量均由微量稱量儀稱取(BioTek)。泛素化產(chǎn)物的相對水平通過使用ECL (Millipore, Billerica, MA)由發(fā)光酶標(biāo)儀(EnVision, PerkinElmer, Waltham, MA)讀取。類似的試驗(yàn)也被用于E1和E2的優(yōu)化,E1或E2系列稀釋的酶用于檢測飽和信號,以保證沒有限速條件。這個(gè)技術(shù)平臺由LifeSensors公司開發(fā)(www.lifesensors.com)。

泛素鏈識別試驗(yàn)

在預(yù)先包被SUMO-UBA2及牛血清白蛋白封閉的96孔板中,由單體泛素或泛素鏈2-7(Boston Biochem, Cambridge, MA)等構(gòu)成的50ul反應(yīng)體系在室溫下孵育30min,用洗板器PBST洗3遍。泛素鏈識別的檢測如上所述。

基于凝膠的體外自動泛素化試驗(yàn)

劑量范圍內(nèi)的SUMO-CARP2與含5 nM Ube1和100 nM UbcH5c的反應(yīng)緩沖液一起在室溫下孵育20min,隨后,反應(yīng)液在變性條件下通過SDS-PAGE分離開,接著轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,沸水中放置5min,用5%脫脂牛奶/PBST封閉,隨后用兔抗泛素一抗(Sigma)及HRP標(biāo)記的兔二抗標(biāo)記(Jackson ImmunoResearch Laboratories),使用ECL試劑(Pierce, Rockford, IL)在數(shù)碼成像儀中觀看結(jié)果。

表觀Km值測定

SUMO-UBA2預(yù)包被及牛血清白蛋白預(yù)封閉的96孔板準(zhǔn)備方法如上。一系列稀釋度的E1激活酶和E2連接酶與泛素(終濃度 1uM)和E6AP(終濃度 16nM)加入到96孔板中,之后加入ATP(終濃度為0.2 mM)后構(gòu)成反應(yīng)體系(50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM MgCl2和1 mMβ-巰基乙醇)以開始E3自動泛素化。測定Ube1飽和信號時(shí),UbcH5c濃度設(shè)定為100 nM;測定E2親和力時(shí),Ube1濃度設(shè)定為5 nM。室溫孵育1h后,PBST洗3遍。多聚泛素的檢測方法如上所述。米氏方程適用于相對速率(RLU/min)測定,利用Prism軟件(GraphPad, San Diego, CA)得出表觀Km值。由于這套試驗(yàn)不能得出絕對速率,因此通過該試驗(yàn)平臺不能得到Vmax。

高通量篩選試驗(yàn)

任何高多樣性的小分子庫都將是兼容的。10mM的測試化合物用100%DMSO稀釋到2.5mM。然后,通過上述方法預(yù)包被UBA2及預(yù)封閉96孔板。隨后,取0.5ul 2.5uM測試化合物至25ul反應(yīng)體系中(測試化合物終濃度為50uM)孵育30min,反應(yīng)體系中其他組成成分終濃度分別為:10 nM Ube1, 200 nM UbcH5c, 16 nM of CARP2,50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM MgCl2和1 mMβ-巰基乙醇。加入含1.1uM泛素和0.4uM ATP的25 ul含50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM MgCl2和1 mM β-巰基乙醇的反應(yīng)液后,自動泛素化開始。20min后,如上所述通過洗板終止反應(yīng),泛素化產(chǎn)物通過上述方法檢測。每個(gè)檢測板設(shè)置內(nèi)對照,使用終濃度為10uM的NEM和1%的DMSO依次作為100%和0%抑制。百分抑制率通過公式:[1 – ((RLUCompoundl – RLUNEM)/(RLUDMSO – RLUNEM))]*100計(jì)算出來,測試化合物的平均百分抑制率為14.9 %,標(biāo)準(zhǔn)偏差為11.3%。與平均百分抑制率相比,抑制CARP2自動泛素化超過四倍標(biāo)準(zhǔn)偏差的化合物為有效化合物,并通過上述方法重新篩選加以驗(yàn)證。

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抗體表位繪圖 http://www.artisky.cn/?p=130 Thu, 08 Nov 2012 02:58:35 +0000 http://yypharm.com/blog/?p=130 簡要過程

抗原編碼基因的PCR擴(kuò)增和超聲分散。端點(diǎn)通過接合作用被克隆和修復(fù),然后重組到大腸桿菌中的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合表達(dá)載體。轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株庫,并且用QPix2XT (Genetix)挑選菌落。培養(yǎng)一段時(shí)間后,細(xì)菌在22.2 × 22.2cm的硝酸纖維素薄膜上形成菌斑。一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的點(diǎn)印跡,用于在Typhoon?掃描器下進(jìn)行熒光檢測。細(xì)胞有一個(gè)積極地(這里的一個(gè)亮點(diǎn))用于質(zhì)粒制備和測序的點(diǎn)。衍生的序列有一致的抗原決定簇。最小重疊序列分別克隆并且受到抗原決定簇驗(yàn)證。

人高多樣性VDR肽庫的產(chǎn)生:
對于庫的構(gòu)建,就像材料和方法上所描述的那樣,PCR擴(kuò)增全長VDR的開放閱讀框,超聲波分散,并克隆到表達(dá)載體用于大腸桿菌中重組蛋白的生產(chǎn)。大約有1 × 106個(gè)獨(dú)立克隆產(chǎn)生,足以成為一個(gè)單一的割裂基因庫(見下文)。創(chuàng)建庫的復(fù)雜性估計(jì)要連續(xù)30個(gè)隨機(jī)選擇的克隆。在長度為17至30個(gè)氨基酸的大概會插入30%, 30個(gè)氨基酸的約50%,30至50個(gè)氨基酸的約20%,所有合適的大小均用于抗原表位繪圖。測序分析儀也表明克隆效率為90%。根據(jù)理論假設(shè),1/6的克隆可以插入正確的框和方向并且有90%的克隆效率,那么至少有150,000個(gè)正確插入的克隆框應(yīng)該存在VDR的片段庫。如此多的開放閱讀框應(yīng)完全覆蓋重疊插入了人VDR基因。

庫的構(gòu)建:
人VDR基因編碼在結(jié)合營養(yǎng)衍生配體中起重要作用,它是一個(gè)核受體家族成員的轉(zhuǎn)錄因子,能施加影響促進(jìn)骨礦物質(zhì)平衡。PBD-GATE2載體克隆人全長VDR核酸序列,通過基因特異引物擴(kuò)增(正向:5′-ATGGAGGCAATGGCGGCCAGCA-3′; 反向:5′- AGGAGATCTCATTGCCAAACA-3′)。用Wizard? SV Gel and PCR Clean-Up System((Promega, Madison, WI))根據(jù)試劑盒的說明純化1.2Kb的PCR產(chǎn)物,然后超聲分散。超聲波處理的DNA瓊脂糖凝膠電泳分離顯示片段下降到100bp。將100-300bp的片段再純化并用End-It? DNA End-Repair Kit(Epicentre, Madison, WI)處理平末端。為了獲得操作的靈活性,我們將片段克隆到設(shè)計(jì)用于特異位點(diǎn)重組克隆的載體(in-house-created Entry vector)。為了達(dá)到這一目的,載體pDONR?/ ZEO(Invitrogen, Carlsbad, CA)配備了一個(gè)平末端克隆的酶切位點(diǎn)。接合pDONR?/Zeo and attL × attR-directed后,重組到細(xì)菌表達(dá)載體pDEST?15 (Invitrogen),獲得個(gè)1 × 106單克隆。

蛋白質(zhì)陣列,菌落斑和重組蛋白表達(dá)的建立
庫中的pDEST?15用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 Star?(DE3)中的感受態(tài)細(xì)胞,細(xì)胞接種到含有氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中。共有2304個(gè)菌落被QPix2XT robot (Genetix, New Milton, Hampshire, UK)挑選到384微孔板含補(bǔ)充氨芐青霉素(100 μg/mL)的液體LB培養(yǎng)基中。培養(yǎng)一段時(shí)間后,培養(yǎng)菌在0.45μm孔徑的PROTRAN?硝酸纖維轉(zhuǎn)化膜(Whatman GmbH, Dassel, Germany)上形成菌斑。細(xì)胞生長在37 °C,在這種覆蓋固體LB培養(yǎng)基的膜上過夜。通過轉(zhuǎn)膜到輔以氨芐青霉素和異丙基-β-D-1-半乳糖苷(IPTG; 0.5 mM)的固體LB培養(yǎng)基上誘導(dǎo)蛋白表達(dá)且在37℃下孵育三小時(shí)。

抗原表位的篩選和檢測
將這些膜上的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有0.02%Tween-20與3%的的印跡高檔奶粉(Carl-Roth GmbH, Karlsruhe, Germany)的PBS中進(jìn)行細(xì)胞溶解,這些釋放的重組蛋白約束在硝化纖維上。為了檢測,所用的是改善的點(diǎn)印記工藝,這是擴(kuò)大到容納22.2×22.2平方厘米大的膜,且熒光標(biāo)記二抗并在Amersham Typhoon? Scanner (Amersham, Pittsburgh, PA)上進(jìn)行熒光掃描。起初用的抗體是市售鼠標(biāo)單克隆IgG2A的抗人類VDR抗體(sc-13133; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)。為了便于,用到的是Alexa Fluor? 488標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(Invitrogen)。用Amersham Typhoon?掃描儀檢測代表陽性抗體結(jié)合的點(diǎn)陣列。在532nm處激發(fā),用526nm的濾光器測量輻射。只有那些在背景下發(fā)出至少100%的熒光信號的點(diǎn)才被視為命中和易于DNA測序。我們通過計(jì)算平均10個(gè)隨機(jī)選取的非熒光點(diǎn)來定義背景。

DNA測序和分析
細(xì)菌培養(yǎng)的在蛋白陣列上代表陽性點(diǎn)的細(xì)胞易于發(fā)生質(zhì)粒脫離。載體特異引物(5′-GGCAAGCCACGTTTGGTG-3′)在ABI 3130 Genetic Analyzer Capillary Array (Applied Biosystems, Foster City, CA)上標(biāo)準(zhǔn)的雙脫氧測序。檢查并校正產(chǎn)生的序列。最小重復(fù)序列用于進(jìn)一步的驗(yàn)證。

Western雜交和免疫熒光
DNA序列編碼由Gateway?兼容的通過第一個(gè)特異的,然后輔以適配引物再克隆到pDONR?/Zeo (Invitrogen)里制造的37個(gè)氨基酸抗原決定簇。經(jīng)過attL×ATTR重組,最小的序列穿梭到pDEST?15(Invitrogen)。首先,用pDEST?15抗原決定簇構(gòu)象轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 Star? (DE3) cells (Invitrogen),并用0.5 mM IPTG在指數(shù)增長階段處理2小時(shí)誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)。用MagneGST?蛋白純化系統(tǒng)(Promega)根據(jù)配套協(xié)議純化重組蛋白。Western雜交操作步驟,純化后的蛋白和天然裂解液用于十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。使用相同的抗VDR抗體。酸性磷酸酶連接的羊IgA抗鼠抗體(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)被用作輔助檢測抗體。在內(nèi)部創(chuàng)建的一個(gè)有終止密碼子的pDEST?15載體被用來作為裂解的陰性對照,來自細(xì)胞全長VDR pDEST?15表達(dá)的細(xì)胞裂解被用作陽性對照。作為一個(gè)驗(yàn)證步驟,純化的抗原表位致使抗VDR單克隆抗體抗原表位結(jié)合位點(diǎn)飽和,作為一個(gè)對照組,等量的非敲除抗VDR單克隆抗體被用到。在ph7.4時(shí)用PBS洗滌密集的6微米人皮膚組織冰凍切片,用4%的甲醛在PBS中固定10min,用0.25% Triton X-100 (AppliChem, Darmstadt, Germany)在PBS中滲透5min,最后用3倍的PBS洗滌5min。用敲除和非敲除的抗VDR單克隆抗體分別在4℃下做過夜處理,對皮膚切片進(jìn)行探索。陸續(xù)在PBS洗滌5min后,Alexa Fluor? 594標(biāo)記的羊抗鼠IgG (Invitrogen)被用來作為在4℃下1小時(shí)潛伏期的輔助檢測抗體。在PBS洗5min后,這些切片用4′,6′-diamidino-2-phenylindole (DAPI; dilution 1:2000 in PBS; Sigma-Aldrich)作最終處理并且用Zeiss Axioskop MC100 (Carl-Zeiss Micro Imaging, G?ttingen, Germany)檢測。

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波浪袋方法—短暫轉(zhuǎn)染大規(guī)模生產(chǎn)單克隆抗體 http://www.artisky.cn/?p=127 Thu, 08 Nov 2012 02:56:31 +0000 http://yypharm.com/blog/?p=127 波浪袋方法—短暫轉(zhuǎn)染大規(guī)模生產(chǎn)單克隆抗體

波浪袋轉(zhuǎn)染用293Fectin.

準(zhǔn)備: 在加入細(xì)胞前, 波浪袋必須充氣.

注意: 波浪袋必須搖動, 否則加熱器不加熱,但開始時(shí)這種加熱并不必要.

器材:
20 L的有螺絲帽鎖住開口的袋子(工作體積 10 L)
自由式 293 培養(yǎng)基 Cat No 12338
Opti-MEMI Cat No 31985
2 毫克無內(nèi)質(zhì)粒DNA
3 毫升293 Fectin 試劑

轉(zhuǎn)染前一天:
稀釋細(xì)胞到 1.0X106個(gè)/毫升的濃度,以確保細(xì)胞處于對數(shù)生長期。

轉(zhuǎn)染的當(dāng)天:
1. 預(yù)熱Opti-MEMI及自由式293 培養(yǎng)基到 37C.
2. 用預(yù)熱的自由式 293培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞到最終容量變3L (暫時(shí)分裝到 2 個(gè)燒瓶, 每個(gè)裝 1.5L), 細(xì)胞的濃度為 1.0 X106 個(gè)細(xì)胞/毫升, 95%以上活細(xì)胞。
3. 試劑-A的準(zhǔn)備: 加 2 毫克DNA 到 100毫升預(yù)熱的Opti-MEMI. 輕輕混合.
4. 試劑-B的準(zhǔn)備: 加 3 毫升 293Fectin 到 100 毫升預(yù)熱的Opti-MEMI,輕輕混合.
5. 室溫下培養(yǎng)不超過 5 分鐘.
6. 5 分鐘后,試劑-A 加到試劑-B里, 輕輕混合. 在室溫下培養(yǎng) 30 分鐘.
7. 30 分鐘后, 加等量的試劑到 2 個(gè)燒瓶里, 輕輕混合. 然后通過螺絲帽口小心倒 3 L 進(jìn)波浪袋.波浪袋給氣含5-6%的CO2 置波浪袋于 7-7.5度的角度, 以17轉(zhuǎn)/分開始啟動.

第3天:
把 3L 預(yù)熱的自由式 293 培養(yǎng)基通過入口泵入波浪袋, 并提高轉(zhuǎn)速到18-19轉(zhuǎn)/分(如果產(chǎn)生過多的泡沫,降低轉(zhuǎn)速), 檢查培養(yǎng)液的酸堿值–至少是6.8.

第6天:
把 3 L 預(yù)熱的自由式 293 培養(yǎng)基通過入口泵入波浪袋, 增快轉(zhuǎn)速到 20-22轉(zhuǎn)/分 (如果產(chǎn)生過多的泡沫則降低轉(zhuǎn)速), 測定培養(yǎng)液的酸堿值.

10天后通過0.2微米過濾器過濾收獲含抗體的液體,最終容量約為 9.2L.

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Me-too研發(fā)很容易嗎? http://www.artisky.cn/?p=123 Tue, 06 Nov 2012 18:36:29 +0000 http://yypharm.com/blog/?p=123 現(xiàn)在舉國上在搞新藥研發(fā)。絕大多數(shù)企業(yè)正確地認(rèn)識到me-too是現(xiàn)在的實(shí)際模式,但我覺得多數(shù)人沒有意識到me-too研發(fā)的難度。Me-too并非只要找到一個(gè)活性,PK類似的化合物就可以了,里面涉及的很多東西可能多數(shù)人沒有什么概念。
首先,如何知道靶標(biāo)。有些情況靶標(biāo)可能容易確定,如DPP4,但很多時(shí)候靶標(biāo)很難確定,如絕大多數(shù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物在使用劑量下都會和很多受體作用,到底哪個(gè)起治療作用不易搞清楚。這樣me-too起來就難了。你得有對生理,病理,藥理有深刻的理解才能有個(gè)優(yōu)化計(jì)劃。

有些靶點(diǎn)對配體有非常嚴(yán)格的要求,如質(zhì)子泵抑制劑,想找到專利保護(hù)外的化合物十分困難。現(xiàn)在合成,篩選通量大大高于從前,專利保護(hù)范圍遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于以前。另外專利搜尋也不是件簡單的事,很多被generic claim保護(hù)的結(jié)構(gòu)都可能導(dǎo)致專利爭端。保證你的化合物安全并不容易做到。在這些限制下,只有非常有經(jīng)驗(yàn)的藥物化學(xué)家才能快速設(shè)計(jì)出me-too水準(zhǔn)的化合物。

能設(shè)計(jì)出活性好的化合物只是一小部分,你還得保證你的化合物不做很多事情(i.e.無副作用)。這一點(diǎn)與原創(chuàng)藥物研發(fā)無大區(qū)別。你的化合物得無hERG, CYP等常見毒性靶標(biāo)活性,在幾種動物無免疫,心臟,肝,腎毒性等。現(xiàn)在藥物優(yōu)化涉及諸多試驗(yàn),GSK的Lapatinib的優(yōu)化據(jù)稱得通過26個(gè)關(guān)口。建立這個(gè)系統(tǒng)非簡單任務(wù)。

Me-too只有十分迅速才有意義,如果你做完了原研藥已專利過期,你的藥物價(jià)值則大打折扣。組建一個(gè)能每步都不出大錯(cuò)的研發(fā)隊(duì)伍并非易事。

Me-too難,me-better則更難。首先,能找到原研藥物的缺點(diǎn)就不是誰都能干的事,看公開的資料,多數(shù)藥都不錯(cuò)。其次,如何改進(jìn)。你得在療效(包括反應(yīng)人群大小),副作用,使用方便性(給藥途徑,次數(shù),藥物相互作用等)的某一方面強(qiáng)于對手。從臨床前性質(zhì)預(yù)測這些臨床性質(zhì)絕對需要高水平的研發(fā)人員。

現(xiàn)在美國一年的研發(fā)經(jīng)費(fèi)約500億美元,每年只有20幾個(gè)新藥,其中大部分是me-too。這是在已有大量經(jīng)驗(yàn)(研究,臨床,報(bào)批,管理)的支持下的成果。Me-too是比新靶標(biāo)容易,但絕不是件容易的事情。中國的企業(yè)要知道這個(gè)事情的難度,做到知己知彼,做好打持久戰(zhàn)的準(zhǔn)備。

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研發(fā)總監(jiān)的素質(zhì) http://www.artisky.cn/?p=121 Tue, 06 Nov 2012 18:33:27 +0000 http://yypharm.com/blog/?p=121 研發(fā)總監(jiān)模糊的工作是掌握公司研發(fā)方向,制定發(fā)展策略,保證科研決策的質(zhì)量。在目前情況下我覺得一個(gè)合格的研發(fā)總監(jiān)需做好以下幾項(xiàng)工作(不包括管理方面,只談技術(shù)):

第一,也是最重要的,是選題立項(xiàng)。某哲人曾說你做什么比你怎么做要重要很多。你需要對整個(gè)新藥的地形有全面的了解,哪個(gè)項(xiàng)目值得做,哪個(gè)不能涉足,哪個(gè)要嚴(yán)密跟蹤如果重要數(shù)據(jù)出現(xiàn)能第一時(shí)間跟進(jìn)。原則上很多項(xiàng)目可以做,但每個(gè)公司的強(qiáng)項(xiàng)不同,所以要結(jié)合自己的強(qiáng)處。一個(gè)常見的錯(cuò)誤是美國上市一個(gè)新藥立即找專利的空子。其實(shí)很多人在你前幾年已經(jīng)開始你的工作了。有人曾研究過現(xiàn)在每個(gè)機(jī)理都會有多個(gè)同類產(chǎn)品。首創(chuàng)者往往是走運(yùn)者,第二的往往是實(shí)力雄厚者,第三,第四往往是失敗者,但第五以后經(jīng)常會出現(xiàn)黑馬。因?yàn)?,3,4是同時(shí)跟進(jìn)的,但資源多的成了老二。但如果你能找到運(yùn)用該機(jī)理的新適應(yīng)癥,或找到更好的優(yōu)化途徑,雖然晚一點(diǎn),但可以有自己的市場。我雖沒有仔細(xì)驗(yàn)證該說法,但的確有一定道理。可以肯定的是,立即跟蹤美國上市藥物而無任何創(chuàng)新的立項(xiàng)策略不可持續(xù)。

第二,知道藥在每個(gè)階段長的什么樣。這個(gè)需要很多實(shí)戰(zhàn)經(jīng)驗(yàn),因?yàn)闀疚墨I(xiàn)上的新藥發(fā)現(xiàn)故事參雜了很多英雄化的情節(jié)。就像現(xiàn)在讓你在某連找一個(gè)能舍身炸碉堡的董存瑞,你要專找濃眉大眼的估計(jì)十有八九要犧牲整個(gè)連,雖然電影上說英雄都長這樣。你要知道沒有一個(gè)藥物會通過所有的臨床前測試,因?yàn)槊總€(gè)測試都有假陰性,假陽性,很多測試不能預(yù)測臨床實(shí)驗(yàn),每個(gè)測試都有波動。一個(gè)藥物要平衡很多因素,不可能每個(gè)性質(zhì)都優(yōu)秀。只有知道藥物在優(yōu)化的每個(gè)階段大概長什么樣,你才能知道你自己的化合物和藥比差多少。我在藥化版講做藥要有殺手的冷靜,你每天接觸很多新數(shù)據(jù),其中魚目混雜,你必須保持十分冷靜的頭腦。不能像蔣干先生一樣拿了周瑜枕邊的信就立刻慶祝去了。也不能幾個(gè)陰性結(jié)果立即就鳴金收兵。

第三,保證決策質(zhì)量。新藥研發(fā)需要做很多決策。你的團(tuán)隊(duì)在長時(shí)間的煎熬中肯定會有對數(shù)據(jù)意想天開的解釋方法,因?yàn)樗腥硕枷M?xiàng)目成功。或者有半途而廢的想法,每個(gè)項(xiàng)目都會遇到非常艱難的時(shí)候,這時(shí)其它項(xiàng)目會顯得更有誘惑力,但你要意識到這經(jīng)常是假象。但你必須是最后的把關(guān)者,必須盡力避免人類做決定時(shí)的種種誤區(qū)。

第四,必須樂觀甚至偏執(zhí)。一旦項(xiàng)目定下,你必須真心實(shí)意相信項(xiàng)目會成功,而且必須說服團(tuán)隊(duì)中每個(gè)人項(xiàng)目一定會成功。沒有一個(gè)項(xiàng)目會一帆風(fēng)順,沒有革命樂觀主義精神是絕不會成功的。

最后,研發(fā)的唯一任務(wù)是發(fā)現(xiàn)新產(chǎn)品,而不是新知識,所以有時(shí)未必十分科學(xué)。比如torcetrapib, 如果從科學(xué)角度講,或許應(yīng)再做一,二個(gè)二期臨床,或許不應(yīng)使用lipitor作背景(ILLUMINATE是比較torcetrapib+lipitor和lipitor自己),或許應(yīng)再耐心點(diǎn)做一個(gè)不生血壓的類似物,但當(dāng)時(shí)Pfizer必須得馬上賭torcetrapib才能彌補(bǔ)lipitor專利過期帶來的銷售損失。

我從未真正做過這個(gè)工作,所以不免紙上談兵,但我目睹了多年的一線新藥研發(fā),并和國內(nèi)幾個(gè)新藥研發(fā)公司有過比較深的接觸,上面的幾點(diǎn)可能是目前中國新藥研發(fā)總監(jiān)需具備的基本素質(zhì)。

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