告別孤獨(dú)：新技術(shù)為蛋白尋找小分子配體

2017年3月4日 | Filed under: 制藥工業(yè),藥物化學(xué),新藥研發(fā),制藥常識(shí),文獻(xiàn)綜合 | Posted by: 路人丙

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【新聞事件】：這一期的《細(xì)胞》雜志發(fā)表一篇化學(xué)生物學(xué)大牛Cravatt及合作者發(fā)表的一篇為蛋白尋找小分子配體的文章。這個(gè)研究使用兩個(gè)關(guān)鍵技術(shù)，只篩選了14個(gè)分子片段就為一千多個(gè)以前沒有已知小分子配體的蛋白找到配體。利用這兩個(gè)技術(shù)和只有450個(gè)片段的小化合物庫他們還找到一個(gè)控制脂肪合成的關(guān)鍵靶點(diǎn)。這個(gè)技術(shù)有望令使用化學(xué)手段發(fā)現(xiàn)、確證靶點(diǎn)更加主流化。

【藥源解析】：現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)靶點(diǎn)的主要手段是基因?qū)W手段，如RNA敲低、基因敲除等。最近CRISPR大規(guī)模基因敲除正成為發(fā)現(xiàn)新靶點(diǎn)的一個(gè)流行技術(shù)。但是基因敲除技術(shù)不能分辨表達(dá)后不同修飾蛋白的功能。如粉狀蛋白雖然在基因?qū)W顯示與阿爾茨海默有關(guān)，但不知是哪種粉狀蛋白。結(jié)果制藥工業(yè)翻個(gè)底兒掉現(xiàn)在也沒找到關(guān)鍵介入點(diǎn)。當(dāng)然這些基因技術(shù)也有其它問題，很多基因?qū)W發(fā)現(xiàn)不能用藥物（小分子或抗體）重復(fù)，所以用化學(xué)手段發(fā)現(xiàn)和確證靶點(diǎn)很重要。

這個(gè)研究使用兩個(gè)關(guān)鍵技術(shù)。一個(gè)是光化學(xué)偶聯(lián)聯(lián)合點(diǎn)擊化學(xué)，把與配體結(jié)合的蛋白從大量沒有結(jié)合的蛋白粥里撈出來或被熒光標(biāo)記。這個(gè)技術(shù)把需要篩選的片段接到一個(gè)含有卡賓前體和一個(gè)炔基的分子結(jié)構(gòu)上。這個(gè)卡賓前體本身穩(wěn)定，但可以被紫外線激活生成卡賓與蛋白的碳?xì)滏I反應(yīng)，把整個(gè)分子接在蛋白上。所以可以等化合物進(jìn)入細(xì)胞后再用紫外線激活。炔基則可以與接在樹脂或熒光化合物的疊氮基團(tuán)在細(xì)胞環(huán)境下反應(yīng)。

因?yàn)榭ㄙe前體加那一個(gè)炔基也可能與部分蛋白結(jié)合造成噪音，所以作者用另一個(gè)關(guān)鍵技術(shù)，即同位素標(biāo)記對(duì)照蛋白消除噪音。他們用正常細(xì)胞與被篩選化合物反應(yīng)，用富含碳13標(biāo)記蛋白的細(xì)胞與對(duì)照化合物（只有卡賓前體和炔基）反應(yīng)。這些實(shí)驗(yàn)都在未被打碎的細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，所以很接近真實(shí)生物過程。然后把這兩類細(xì)胞打碎、混合、分離蛋白、用質(zhì)譜比較被篩選化合物烷基化了哪些蛋白。

利用這兩個(gè)技術(shù)作者發(fā)現(xiàn)這14個(gè)分子片段可以與大量不同類型蛋白結(jié)合。因?yàn)檫@些化合物與蛋白通過共價(jià)鍵連起來，所以通過多肽片段分析可以找到結(jié)合位點(diǎn)。與這14個(gè)片段結(jié)合蛋白居然有83%沒有已知配體。這些分子都很簡單，所以這些蛋白之所以沒有已知配體可能是因?yàn)樗鼈儧]有可靠的生物學(xué)功能，否則要通過HTS篩也應(yīng)該能找到這14個(gè)片段的類似物作為配體。但這正是這個(gè)工作的意義，即用小分子研究這些蛋白的功能。

某個(gè)蛋白有了有一定結(jié)合能的配體后，這個(gè)配體可以作為探針（通常用熒光標(biāo)后和新化合物競爭與蛋白的結(jié)合）來尋找選擇性、活性更好的化合物，這是先導(dǎo)物優(yōu)化的常用技術(shù)。因?yàn)檫@14個(gè)片段與1000多蛋白結(jié)合，所以選擇性肯定是不好。作者挑了兩個(gè)蛋白（PTGR2和SLC25A20）作為例子確實(shí)找到了活性更好的配體。這些高質(zhì)量配體則可以更可靠地研究這些蛋白的生物功能。

這個(gè)技術(shù)組合的另一個(gè)應(yīng)用是細(xì)胞篩選后確定尋分子靶點(diǎn)。作者用一個(gè)稍大的化合物庫在整體細(xì)胞水平篩選脂肪合成抑制劑。通過一系列精巧的對(duì)照試驗(yàn)，只有一個(gè)分子靶點(diǎn)（PGRMC2）可以解釋苗頭化合物的脂肪抑制功能。所以PGRMC2可能成為糖尿病、脂代謝失調(diào)新藥的一個(gè)新靶點(diǎn)。

這個(gè)技術(shù)因?yàn)樾枰粋€(gè)卡賓前體和一個(gè)炔基，所以只能篩選分子量較小的片段，否則過膜可能成為一個(gè)障礙。但這個(gè)工作只用了十幾個(gè)結(jié)構(gòu)類型就為上千蛋白找到配體，如果擴(kuò)大化合物庫應(yīng)該會(huì)為更多蛋白找到伴侶，所以還是威力非常巨大的靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)技術(shù)。

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