波浪袋方法—短暫轉(zhuǎn)染大規(guī)模生產(chǎn)單克隆抗體

2012年11月8日 | Filed under: 新藥研發(fā),推薦技術(shù),文獻綜合 | Posted by: 朱貴東

波浪袋方法—短暫轉(zhuǎn)染大規(guī)模生產(chǎn)單克隆抗體

波浪袋轉(zhuǎn)染用293Fectin.

準備: 在加入細胞前, 波浪袋必須充氣.

注意: 波浪袋必須搖動, 否則加熱器不加熱，但開始時這種加熱并不必要.

器材:
20 L的有螺絲帽鎖住開口的袋子(工作體積 10 L)
自由式 293 培養(yǎng)基 Cat No 12338
Opti-MEMI Cat No 31985
2 毫克無內(nèi)質(zhì)粒DNA
3 毫升293 Fectin 試劑

轉(zhuǎn)染前一天:
稀釋細胞到 1.0X106個/毫升的濃度，以確保細胞處于對數(shù)生長期。

轉(zhuǎn)染的當天:
1. 預(yù)熱Opti-MEMI及自由式293 培養(yǎng)基到 37C.
2. 用預(yù)熱的自由式 293培養(yǎng)基稀釋細胞到最終容量變3L (暫時分裝到 2 個燒瓶, 每個裝 1.5L), 細胞的濃度為 1.0 X106 個細胞/毫升， 95%以上活細胞。
3. 試劑-A的準備: 加 2 毫克DNA 到 100毫升預(yù)熱的Opti-MEMI. 輕輕混合.
4. 試劑-B的準備: 加 3 毫升 293Fectin 到 100 毫升預(yù)熱的Opti-MEMI,輕輕混合.
5. 室溫下培養(yǎng)不超過 5 分鐘.
6. 5 分鐘后,試劑-A 加到試劑-B里, 輕輕混合. 在室溫下培養(yǎng) 30 分鐘.
7. 30 分鐘后, 加等量的試劑到 2 個燒瓶里, 輕輕混合. 然后通過螺絲帽口小心倒 3 L 進波浪袋.波浪袋給氣含5-6%的CO2 置波浪袋于 7-7.5度的角度, 以17轉(zhuǎn)/分開始啟動.

第3天:
把 3L 預(yù)熱的自由式 293 培養(yǎng)基通過入口泵入波浪袋, 并提高轉(zhuǎn)速到18-19轉(zhuǎn)/分(如果產(chǎn)生過多的泡沫，降低轉(zhuǎn)速), 檢查培養(yǎng)液的酸堿值–至少是6.8.

第6天:
把 3 L 預(yù)熱的自由式 293 培養(yǎng)基通過入口泵入波浪袋, 增快轉(zhuǎn)速到 20-22轉(zhuǎn)/分 (如果產(chǎn)生過多的泡沫則降低轉(zhuǎn)速), 測定培養(yǎng)液的酸堿值.

10天后通過0.2微米過濾器過濾收獲含抗體的液體，最終容量約為 9.2L.

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