細胞內(nèi)高通量篩選雄激素受體配體

2018年1月11日 | Filed under: 文獻綜合 | Posted by: 路人丙

【新聞事件】：這一期的《Scientific Report》發(fā)表了一個阿斯列康科學家通過細胞內(nèi)TSA（CETSA）篩選雄激素受體（AR）拮抗劑的工作（doi:10.1038/s41598-017-18650-x）。這個工作用一個AR激動劑（DHT）飽和AR，從而增加AR的熱穩(wěn)定性。然后篩選了一個包括已知AR拮抗劑的化合物庫，AR拮抗劑因為和DHT競爭結(jié)合位點令AR熱穩(wěn)定性下降。這個篩選可以區(qū)分、排序已知的AR拮抗劑，并可以區(qū)分間接AR調(diào)控劑（雖然影響AR信號但不是直接和AR結(jié)合）。因為這個測試是與DHT的競爭，所以也第一次在細胞內(nèi)復雜環(huán)境測量了AR拮抗劑的抑制常數(shù)（Ki）。

【藥源解析】：AR是前列腺癌的重要誘因，雄激素合成抑制劑Zytiga去年在早期前列腺癌患者中降低38%死亡，成為ASCO重磅。Xtandi是AR直接拮抗劑，也是重磅藥物，去年被輝瑞收購。有望成為第一個進入臨床的PROTAC藥物ARV-110也是降解AR。可見AR依然是個非常重要的靶點。

通常化合物的靶點活性是通過純化蛋白系統(tǒng)測量，但這個系統(tǒng)一般在緩沖液里，與真正的細胞內(nèi)環(huán)境相差很大。細胞內(nèi)有大量與小分子化合物結(jié)合的蛋白，降低藥物有效濃度。化合物即使能進入細胞也也不一定能有效進入靶點所在的小區(qū)，所以活性好未必能見到靶點。另外因為技術原因純化蛋白經(jīng)常不是整個蛋白，而是其中一段，片段蛋白與小分子配體結(jié)合力可能與整個蛋白不同。最后蛋白在細胞內(nèi)可能與其它蛋白形成復合物才有活性，這個性質(zhì)在純化系統(tǒng)中也不存在。這類似學英語時帶耳機聽標準英語與在酒吧嘈雜的環(huán)境里與有口音美國人交流的區(qū)別。

所以很多在純化系統(tǒng)活性很高的化合物在真正的細胞內(nèi)活性并不好，造成出現(xiàn)PK-PD失聯(lián)。而細胞內(nèi)的靶點結(jié)合能力并不容易測量，通常細胞試驗都是間接測量目標靶點活性，不能區(qū)分靶點活性和通路活性。這個可能增加開發(fā)風險，因為靶點一般通過基因?qū)W實驗確證，只有直接與目標蛋白結(jié)合才最可能重復基因?qū)W數(shù)據(jù)。抑制通路上其它蛋白雖然可以改變目標參數(shù)，但不一定能完全與抑制目標蛋白功能一致。

近年來出現(xiàn)幾個直接策略細胞內(nèi)與靶點結(jié)合的技術，CETSA是其中之一。這個技術不需要標記蛋白、也不需要標記化合物，所以比較容易操作。蛋白與配體結(jié)合后通常熱穩(wěn)定會增加，所以通過加熱被化合物處理過的細胞、追蹤目標蛋白的變性溫度與化合物濃度關系可以測量化合物在細胞內(nèi)與目標蛋白直接結(jié)合的能力。這個實驗與一般CETSA還有所不同，因為作者發(fā)現(xiàn)AR拮抗劑與AR結(jié)合并不改變變性溫度，但激動劑DHT則可增加熱穩(wěn)定性。拮抗劑可以取代DHT因此把AR熱穩(wěn)定恢復到游離AR水平。這個工作說明CETSA可以作為高通量篩選平臺。理論上CETSA也可同時跟蹤不同蛋白而測定化合物在細胞內(nèi)復雜環(huán)境下的選擇性，這可能是對小分子藥物研發(fā)更重要的工作。

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