新型E3泛素連接酶抑制劑高通量篩選試驗(yàn)

2012年11月8日 | Filed under: 新藥研發(fā),推薦技術(shù),文獻(xiàn)綜合 | Posted by: 朱貴東

應(yīng)用：腫瘤
基本原理：
泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在多種細(xì)胞事件的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，其失調(diào)可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生，尤其是腫瘤的發(fā)生。硼替佐米/萬(wàn)珂為蛋白酶抑制劑，已被批準(zhǔn)用于治療多發(fā)性骨髓瘤。E3泛素連接酶與經(jīng)典的E1、E2酶功能一致，募集特定的底物，并協(xié)調(diào)其泛素化狀態(tài)以及隨后的蛋白酶降解或細(xì)胞活性改變。E3連接酶與包括腫瘤在內(nèi)的一系列病癥相關(guān)，因此，在藥物開(kāi)發(fā)中快速經(jīng)濟(jì)地檢測(cè)其活性是十分可取的。適用于E3連接酶的高通量篩選試驗(yàn)的相對(duì)缺乏已大大阻礙了E3的抑制劑的開(kāi)發(fā)，并減緩了這個(gè)關(guān)鍵領(lǐng)域的藥物研究。該方法描述了一種新型適用于E3連接酶試驗(yàn)的平臺(tái)，該平臺(tái)利用了泛素鏈中泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的固有親和力的優(yōu)勢(shì)，允許對(duì)E3連接酶依賴的泛素鏈形成的分析。該方法已成功應(yīng)用于RING和HECT家族，表明該平臺(tái)在分析E3連接酶時(shí)的廣泛應(yīng)用。

方法、材料
除非另有說(shuō)明，所有試劑均購(gòu)自Sigma公司（圣路易斯，密蘇里州），且所有試劑級(jí)至少為試劑級(jí)或更好。質(zhì)粒編碼Ube1，MuRF1 ，Hrd1的cDNA購(gòu)自O(shè)pen Biosystems公司（漢茨維爾，AL ）。
克隆和蛋白表達(dá)：

表達(dá)SUMO化UBA2酶，包括Rad23 (殘基351-398), 僅K48泛素化 (K6R, K11R, K27R, K29R, K33R, and K63R), 6His-Ube1, 6His-UbcH5b, 6His-UbcH5c, 6His-UbcH7, SUMO-CARP2, SUMO-CARP2 (H333A), SUMO-MuRF1, 6His-E6AP和 SUMO-Hrd1 (殘基235-617)，的大腸桿菌BL21 (DE3)的克隆、表達(dá)、純化均按標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)操作，并且使用SUMOpro融合載體（ LifeSensors公司，賓州，Malvern）。所有構(gòu)建的結(jié)構(gòu)均完全測(cè)序，以驗(yàn)證其野生型序列或檢查引入的點(diǎn)突變。

E3連接酶的UBA自動(dòng)泛素化實(shí)驗(yàn)

96孔中等結(jié)合板（賽默飛世爾科技，羅克福德，IL ）在洗滌及3%牛血清白蛋白阻斷之前，用純化的SUMO化UBA2酶孵育。SUMO化UBA2酶通過(guò)疏水相互作用被動(dòng)吸附從而被非特異固定。在一個(gè)典型的檢測(cè)，每孔由不同濃度的E3連接酶與5nM Ube1、100nM E2和1.1 μM K48泛素化一起構(gòu)成的50μL反應(yīng)緩沖液（ 50mM Tris-HCl [pH值8.0], 5mM MgCl2，0.2mM ATP，1 mM β-巰基乙醇）孵育。室溫孵育一段固定時(shí)間（在最初的線性范圍內(nèi)）后，用洗板器(BioTek, Winooski, VT)0.1%PBST洗3遍。5%牛血清白蛋白/PBST稀釋的抗泛素兔抗（稀釋度 1:50）(Sigma)及FITC/HRP標(biāo)記的兔二抗（稀釋度 1:10,000）(ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)連續(xù)孵育1小時(shí)，且每次孵育后用PBST洗板。所有散裝試劑的稱量均由微量稱量?jī)x稱取(BioTek)。泛素化產(chǎn)物的相對(duì)水平通過(guò)使用ECL (Millipore, Billerica, MA)由發(fā)光酶標(biāo)儀(EnVision, PerkinElmer, Waltham, MA)讀取。類似的試驗(yàn)也被用于E1和E2的優(yōu)化，E1或E2系列稀釋的酶用于檢測(cè)飽和信號(hào)，以保證沒(méi)有限速條件。這個(gè)技術(shù)平臺(tái)由LifeSensors公司開(kāi)發(fā)(www.lifesensors.com)。

泛素鏈識(shí)別試驗(yàn)

在預(yù)先包被SUMO-UBA2及牛血清白蛋白封閉的96孔板中，由單體泛素或泛素鏈2-7(Boston Biochem, Cambridge, MA)等構(gòu)成的50ul反應(yīng)體系在室溫下孵育30min，用洗板器PBST洗3遍。泛素鏈識(shí)別的檢測(cè)如上所述。

基于凝膠的體外自動(dòng)泛素化試驗(yàn)

劑量范圍內(nèi)的SUMO-CARP2與含5 nM Ube1和100 nM UbcH5c的反應(yīng)緩沖液一起在室溫下孵育20min，隨后，反應(yīng)液在變性條件下通過(guò)SDS-PAGE分離開(kāi)，接著轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，沸水中放置5min，用5%脫脂牛奶/PBST封閉，隨后用兔抗泛素一抗(Sigma)及HRP標(biāo)記的兔二抗標(biāo)記(Jackson ImmunoResearch Laboratories)，使用ECL試劑(Pierce, Rockford, IL)在數(shù)碼成像儀中觀看結(jié)果。

表觀Km值測(cè)定

SUMO-UBA2預(yù)包被及牛血清白蛋白預(yù)封閉的96孔板準(zhǔn)備方法如上。一系列稀釋度的E1激活酶和E2連接酶與泛素（終濃度 1uM）和E6AP（終濃度 16nM）加入到96孔板中，之后加入ATP（終濃度為0.2 mM）后構(gòu)成反應(yīng)體系（50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM MgCl2和1 mMβ-巰基乙醇）以開(kāi)始E3自動(dòng)泛素化。測(cè)定Ube1飽和信號(hào)時(shí)，UbcH5c濃度設(shè)定為100 nM；測(cè)定E2親和力時(shí)，Ube1濃度設(shè)定為5 nM。室溫孵育1h后，PBST洗3遍。多聚泛素的檢測(cè)方法如上所述。米氏方程適用于相對(duì)速率(RLU/min)測(cè)定，利用Prism軟件(GraphPad, San Diego, CA)得出表觀Km值。由于這套試驗(yàn)不能得出絕對(duì)速率，因此通過(guò)該試驗(yàn)平臺(tái)不能得到Vmax。

高通量篩選試驗(yàn)

任何高多樣性的小分子庫(kù)都將是兼容的。10mM的測(cè)試化合物用100%DMSO稀釋到2.5mM。然后，通過(guò)上述方法預(yù)包被UBA2及預(yù)封閉96孔板。隨后，取0.5ul 2.5uM測(cè)試化合物至25ul反應(yīng)體系中(測(cè)試化合物終濃度為50uM)孵育30min，反應(yīng)體系中其他組成成分終濃度分別為：10 nM Ube1, 200 nM UbcH5c, 16 nM of CARP2，50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM MgCl2和1 mMβ-巰基乙醇。加入含1.1uM泛素和0.4uM ATP的25 ul含50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM MgCl2和1 mM β-巰基乙醇的反應(yīng)液后，自動(dòng)泛素化開(kāi)始。20min后，如上所述通過(guò)洗板終止反應(yīng)，泛素化產(chǎn)物通過(guò)上述方法檢測(cè)。每個(gè)檢測(cè)板設(shè)置內(nèi)對(duì)照，使用終濃度為10uM的NEM和1%的DMSO依次作為100%和0%抑制。百分抑制率通過(guò)公式：[1 – ((RLUCompoundl – RLUNEM)/(RLUDMSO – RLUNEM))]*100計(jì)算出來(lái)，測(cè)試化合物的平均百分抑制率為14.9 ％，標(biāo)準(zhǔn)偏差為11.3％。與平均百分抑制率相比，抑制CARP2自動(dòng)泛素化超過(guò)四倍標(biāo)準(zhǔn)偏差的化合物為有效化合物，并通過(guò)上述方法重新篩選加以驗(yàn)證。

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