藥物新靶點(diǎn)和基于384孔板高通量篩選的最佳實(shí)驗(yàn)方案
第一部分 基于shRNA的方法
質(zhì)粒構(gòu)建
構(gòu)建報(bào)告基因質(zhì)粒：luciferase（pGL3; Promega, Madison, WI, or Genbank U47295） 基因克隆到pLLB3-GW-Kan慢病毒載體，限制酶切位點(diǎn)為Xba1 和Nhe1。新的序列確認(rèn)無誤的命名為pLLB3-GW-KanpGL3。
病毒包裝
1、HEK293T細(xì)胞以7.8×105數(shù)量重懸于2ml無抗生素含10% FBS 接種至六孔板（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, or Fisher,Pittsburgh, PA），放置于37° C, 5% CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)過夜。
2、取1.5ml滅菌EP管，加入1.5μg包裝混合質(zhì)粒和0.3μg表達(dá)質(zhì)粒以及282μl的無血清培養(yǎng)基，18 ul Fugene 6 (Roche, Basel, Switzerland)輕柔混勻，室溫孵育30min。
3、將DNA溶液和轉(zhuǎn)染試劑加入鋪板的293細(xì)胞中，37° C, 5% CO2培養(yǎng)，過夜。
4、移除含有DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)基移除，代之以含10%FBS和1%青霉素-鏈霉素DMEM培基。培養(yǎng)過夜。
5、收集轉(zhuǎn)染后48h的細(xì)胞上清，更換為完全培基。
6、轉(zhuǎn)染后72h，收集細(xì)胞上清，與48h收集的上清混合。
7、用0.45um的聚二氟乙烯過濾器（(Millipore, Billerica, MA)）去除含病毒上清中的非貼壁細(xì)胞，分裝，凍存于-80°冰箱。
病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)
1、 SKOV3、A549、Hela、MDA-MB-231或Panc 4.03 細(xì)胞以 200,000/孔接種于六孔板。
2、24h后，用1.5ml 含8 ug/ml 聚凝胺(Sigma, St. Louis, MO)和10 mM HEPES (Gibco, Carlsbad,CA)的完全培基更換。加入190ul的含病毒上清，以2100 rpm (1000g)速度輕輕搖動(dòng)細(xì)胞1.5h。
注意：病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的最適條件在不同的細(xì)胞系之間有差異。但由于luciferase報(bào)告基因的高表達(dá)，此步優(yōu)化不是特別關(guān)鍵。在siRNA轉(zhuǎn)染前至少孵育3h（標(biāo)準(zhǔn)的是與病毒共孵育24h，但轉(zhuǎn)染前孵育3h即可）。
第二部分 基于siRNA 的方法
siRNA轉(zhuǎn)染
1、在384-well組織培養(yǎng)皿中將每份lipid反應(yīng)物與4ul的Opti-MEM-I混合。
2、在4ul Opti-MEM-I中加入206 nM siRNA，并與lipid反應(yīng)物混合,孵育30min。
（該體系中siRNA濃度為25nM，如果siRNA濃度需要調(diào)整，可以進(jìn)行稀釋。）
3、用磷酸鹽緩沖液沖洗luciferase-transduced細(xì)胞2次，胰酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)，種入384孔板中。
4、For a forward transfection, 將混合物加入25ul完全培基培養(yǎng)了24h的細(xì)胞中。
5、For a reverse transfection，將25ul細(xì)胞加入使用lipid自動(dòng)分散裝置且包含有siRNA的混合培養(yǎng)物中，孵育72h。
注意：每個(gè)細(xì)胞系根據(jù)經(jīng)驗(yàn)檢測(cè)分析每個(gè)孔中2個(gè)細(xì)胞之間的密度。檢測(cè)luciferase活性使用Bright-Glo regent (Promega)，檢測(cè)細(xì)胞存活能力使用Cell Titer Glo cell viability (Promega)。所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)必需經(jīng)過三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果的平均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差必須反映在圖表上。
Control siRNA stocks：材料及訂購(gòu)信息
A、Diluted Dharmacon stock siRNAs (GFP) (cat# P-002102-01-05)
靶序列(GFP) 5′-GCG ACG TAA ACG GCC ACA AGT TC-3′
B 、Dharmacon luciferase(pGL3)siRNAs
高度沉默子（cat# D-002050-01-05)靶序列5′-GAT TAT GTC CGG TTA TGT ATT-3′，
中間沉默子(cat# D-002050-02-20)靶序列5′-CTG AAT ACA AAT CAC AGA ATT-3′,
低沉默子?? (cat# D-002050-03-20)靶序列5′-TCC GGA AGC GAC CAA CGC CTT-3′。
C、甘油醛三磷酸脫氫酶(GAPDH)(cat# MQ-004253-01)
D、甲羥戊酸（二磷酸）脫羧酶(MVD) (cat# MQ-006748-00)
E、磷脂酰肌醇-4-激酶催化多肽 (PIK4CB) (cat# MQ-006777-02)
F、pGL2 luciferase (cat# D-001100-01-05)
進(jìn)行QPCR的siRNAs實(shí)驗(yàn)包括caspase-8 (cat# M-003466-04)和MKSTYX (cat# M-008031-01)，Dharmacon SMART pools 和TNFRSF1A (cat# MQ-005197-00),而 YARS (cat# MQ-011498-00)以及 TRIB3 (cat# MQ-003754-01) 則作為獨(dú)立的Dharmacon siRNAs。
第三部分? 質(zhì)量控制
實(shí)時(shí)熒光定量PCR
1、兩孔分別轉(zhuǎn)染siRNA之后，用RNeasy96試劑盒(Qiagen, Venlo, the Netherlands)抽提mRNA。
2、DNAse 1預(yù)處理兩次，每次15分鐘。
3、用High Capacity cDNA Archive試劑盒(Applied Biosystems, Foster City, CA)合成cDNA，其中引物為oligo dT25 (Sigma Genosys)、緩沖液中含有MgCl2 (Ambion, Foster City,CA)。
cDNA合成體系
| 成分 | 體積 ul |
| 10x緩沖液 | 10 |
| 1 M MgCl2 | 0.55 |
| 100 mM dNTPs | 4 |
| 20 U/ul RNasIn | 1 |
| 50 U/ul Multiscribe | 5 |
| 雙蒸水 | 12.45 |
| RNA | 67 |
| 合計(jì)：100 |
4、在Applied Biosystems 7900HT系統(tǒng)上，以SYBR? Green為染料，擴(kuò)增下列引物（Sigma），定量檢測(cè)cDNA
① caspase-8 (NM_001228)
| GGTCACTTGAACCTTGGGAA | GAACTTGAGGGAGGCCAGAT |
| 堿基：203到328，跨越229位32347 bp的內(nèi)含子 | |
②MKSTYX (NM_016086)
| ACATCCTGAAAGGGGGCTAT | GCACGATTTCAATGGGGTAT |
| 堿基：716到836，跨越795位8333 bp的內(nèi)含子 | |
③TNFRSF1A (NM_001065)
| GCTTCAGAAAACCACCTCAGACA | ATGCCGGTACTGGTTCTTCCT |
| 堿基：551到662 |
④YARS (NM_003680)
| GCCCTGAAGAGAAACTGCAC | GGGCACAAAGTAAGCCACAT |
| 堿基：804到953，跨越845位6128 bp的內(nèi)含子 | |
⑤TRIB3 (NM_021158)
| TCAAGCTGTGTCGCTTTGTC | CTTGTCCCACAGGGAATCAT |
| 堿基：1053到1163，跨越1090位4616 bp的內(nèi)含子 | |
不同細(xì)胞系的推薦接種密度（針對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)分析）
表1 、384孔板每孔接種細(xì)胞密度（低/高）
表2、 384孔板轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化
| ???????? 細(xì)胞系?????????????????????????????????? 384孔 |
| ???????? Hela???? ????????????????????????????????750/1500 |
| ???????? Hek293?????????????????????????????????? 2500/5000 |
| ???????? SKOV3??????????????????????????????????? 750/1500 |
| ???????? A549???????????????????????????????????? 750/1500 |
| ???????? HCT116????????????????? ?????????????????1000/2000 |
| ???????? Huh7???????????????????????????????????? 1000/2000 |
| ???????? A673???????????????????????????????????? 2500/5000 |
| ???????? XMD5???????????????????????????????????? 750/1500 |
| ???????? UMR????????????????????????????????? ????750/1500 |
| ???????? MDA-MB-231?????????????????????????????? 750/1500 |
| ????? ???Panc 4.03??????????????????????????????? 750/1500 |
| ?細(xì)胞系??????????? 細(xì)胞數(shù)/孔????????? 轉(zhuǎn)染試劑???????? 試劑體積/孔 |
| ? Hela????????????? 750/1500???????? Dharmafect4????????? 0.07 |
| ? Hek293??????????? 2500/5000??????? Dharmafect4????????? 0.07 |
| ?SKOV3???????????? 750/1500???????? Dharmafect2????????? 0.03 |
| ?A549????????????? 750/1500???????? Dharmafect1????????? 0.07 |
| ? HCT116??????????? 1000/2000??????? Dharmafect3????????? 0.07 |
| ? Huh7????????????? 1000/2000??????? Lipofectamine2000??? 0.03 |
| ?A673????????????? 2500/5000??????? Dharmafect3????????? 0.03 |
| ??XMD5????????????? 750/1500???????? Dharmafect1????????? 0.07 |
| ? UMR?????????????? 750/1500???????? Dharmafect1????????? 0.03 |
| ?MDA-MB-231??????? 750/1500???????? Dharmafect4????????? 0.03????????? |
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