人類長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4 和5的高通量篩選試驗(yàn)的發(fā)展和驗(yàn)證

2012年11月8日 | Filed under: 新藥研發(fā),推薦技術(shù),文獻(xiàn)綜合 | Posted by: 朱貴東

應(yīng)用: 代謝性疾病

理由: 食物中的長鏈脂肪酸的跨細(xì)胞膜的吸收主要由脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(FATP)傳遞. 在人類和rodent動物體內(nèi)這種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有6個不同表達(dá)的亞型存在.為了方便對抗FATP亞型的藥物的開發(fā), 這個實(shí)驗(yàn)采用哺乳動物細(xì)胞系穩(wěn)定表達(dá)重組人類FATP 4 和5,并開發(fā)一種使用一個96孔熒光成像板閱讀儀(FLIPR)的高通量篩選(HTS)的檢測. LCFA吸收的信號對背景之比是在3-5倍之間. 兩種化合物產(chǎn)生對FATP 4的抑制, 其1/2最大抑制濃度(IC50)分別是0.21和0.63 uM, 并顯示選擇性超過FATP5約100倍. 從美國藥物收集庫篩選對抗FATP 5 的藥物觀察到約0.4% 的命中率. 兩種被證實(shí)的有效物是膽汁酸,其IC50 分別是2.4 和0.22 uM. 為增加產(chǎn)量,用分析HT發(fā)展了一種在一個384孔形式中的單一時(shí)間測定的方法, 其結(jié)果可與96孔板方式相比. 總之,基于細(xì)胞的FATP 4 和5 的熒光檢測適合于一個主要的藥物篩選, 而分化的細(xì)胞系可用于輔助藥物的篩選.

方法:
. Hs FATP 4 和5穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株和試劑:
人類胚胎腎(HEK)293 細(xì)胞株的建立能穩(wěn)定表達(dá)人類重組HsFATP1,4,和5已在以前描述過. 4種細(xì)胞培養(yǎng)基和補(bǔ)充物購自Gibco Invitrogen (Invitrogen, CarIsbad, CA); QBT 脂肪酸檢測盒從MDS 分析技術(shù)(原Molecular Device Co, Sunyvale, CA)購得; 鵝去氧膽酸, 油酸,棕捛油都購自Sigma-Aldrich(St.Louis, MO). 兩種FATP4抑制劑, j3 和 j5, 都是根據(jù)最進(jìn)發(fā)表的文章而合成. 美國藥物收集庫(USDC)由已知藥理的1040種化合物組成, 29 種化合物購于Microsouce (Gaylordsville, CT). 所有的化合物都溶解在濃度為10mM的二甲基亞砜中作為儲備溶液.
細(xì)胞培養(yǎng): hsFATP1, 4,或5的細(xì)胞及載體控制的HEK293細(xì)胞被接種于含有2250毫克/升D-葡萄糖, 維生素B6, 0.5 CaCl2, 輔以10% 胎牛血清(FBS)和100個單位的青霉素-100微克鏈霉素/毫升及加有1毫克/毫升G418 (基因選擇)的Dulbecco”s 改良Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM).細(xì)胞接種到有PDL涂層的,黑色壁,透明底部的微孔板(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). 當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80,000/孔時(shí)用96孔板方法, 或者在20,000/孔時(shí)用384孔板方式. 在接種后12-16 小時(shí),平板可用于測定.
3T3-L1 前脂肪細(xì)胞,(美國型培養(yǎng)物收集, 貨號CCL92-1), 按照發(fā)表的文章的方法分化細(xì)胞. 24,25細(xì)胞分化的測定通過在顯微鏡下目視脂滴的積累. 在進(jìn)行檢測之前12-16小時(shí),當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到100,000/孔時(shí)接種到96孔平板.

QBT kit和熒光強(qiáng)度測量
QBT混合物按夾在產(chǎn)品中的指示(R8133,MDS Analytical Technologies)進(jìn)行準(zhǔn)備并包括專有的抑制劑和2uM熒光標(biāo)記的脂肪酸腎上腺素-FA。細(xì)胞防滲抑制劑有效抑制在溶液中腎上腺素-FA熒光。細(xì)胞吸收了腎上腺素-FA，細(xì)胞內(nèi)的熒光測定采用自下而上閱讀探測器FLIPR或分析師HT（兩種都來自MDS分析技術(shù)）。所有合成的小分子溶解在DMSO作為儲備溶液，然后稀釋用1×充填緩沖液（1×漢克氏平衡鹽溶液加有20mM的HEPES緩沖液和0.2％無脂肪酸牛血清白蛋白[BSA]）。在96孔板方式中做動力測定, 平板中的培養(yǎng)基用150微升1×充填緩沖液加50微升稀釋的濃度在5×的化合物（或175微升1×充填緩沖液加25微升稀釋的濃度在10×的化合物）在37°C在5％二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)30分鐘。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，加入50微升的QBT混合物到培養(yǎng)孔. 為檢查脂肪酸衍生物的抑制效應(yīng)，我們把培養(yǎng)的混合物溶解在乙醇里作為儲備溶液, 然后用1×充填緩沖液稀釋。在4C下. 在添加到培養(yǎng)平板做吸收測定之前,這個稀釋物用QBT混合物進(jìn)行平衡24小時(shí)。在把QBT混合物加入到細(xì)胞后，立即用FLIPR進(jìn)行熒光讀數(shù). 室溫下FLIPR的激發(fā)過濾器波長λex=488納米,而排放過濾器的發(fā)射波長= 540 nm。在384孔的格式中, 用單一時(shí)間點(diǎn)檢測的方法, 培養(yǎng)基要換成35微升1×充填緩沖液加5微升10×濃度的稀釋化合物
在5％CO2培養(yǎng)箱在37℃培養(yǎng)30分鐘. 在培養(yǎng)結(jié)束時(shí),10微升QBT混合物添加到培養(yǎng)孔. 然后, 隨著染料的培養(yǎng), 在1分鐘,1小時(shí),每孔的熒光密度用分析師 HT進(jìn)行測量, 在室溫下其發(fā)射過濾器波長λex=488納米，排放過濾器的波長=540納米。以雙盲的方式進(jìn)行先導(dǎo)藥物篩選.有效者仍用密碼直到完成濃度反應(yīng)試驗(yàn)的證實(shí)再解碼.
。
數(shù)據(jù)分析:

動力學(xué)分析，用FLIPR連續(xù)觀察吸收腎上腺素-FA 1小時(shí). 每孔的相對熒光
單位（RFU）的水平通過減去在第一數(shù)據(jù)點(diǎn)的熒光水平. 在1小時(shí)的觀察后終端點(diǎn)的相對熒光單位(RFU)，作為最大的脂肪酸攝取量.在384孔格式的單一時(shí)間點(diǎn)檢測, 每孔的絕對熒光強(qiáng)度作為最大的脂肪酸攝取量. 在主要的檢測方法開發(fā)中熒光信號的百分比變化（抑制或增強(qiáng)）與實(shí)驗(yàn)對照組比較按照雙重測量的平均值計(jì)算.。因?yàn)槲覀儫o法測定培養(yǎng)孔中最后的游離脂肪酸濃度，抑制脂肪酸的效力是基于起始濃度的假設(shè),即在生長介質(zhì)中脂肪酸結(jié)合類似程度的的蛋白質(zhì)。同樣，小分子的藥效是根據(jù)他們所表現(xiàn)的摩爾濃度而估計(jì)，因?yàn)槲覀儧]有確定其蛋白結(jié)合全貌。濃度反應(yīng)曲線建造,并能適合一個4個參數(shù)的S 型函數(shù)以產(chǎn)生最大半抑制濃度（IC50）。適當(dāng)?shù)那闆r下，數(shù)據(jù)代表平均值}SEM至少3 次測量。

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