建立穩(wěn)定生產(chǎn)表達IGF-1R細胞株以供篩選抗IGF-1R單克隆抗體（mAB）或小分子酪氨酸激酶抑制劑所用

2012年11月8日 | Filed under: 新藥研發(fā),推薦技術,文獻綜合 | Posted by: 朱貴東

該方法也適用于其它類型的致癌酪氨酸激酶(RTKS)受體

建立一個能誘導表達IGF-1R的 MEF細胞系株
克隆編碼IGF-1RcDNA 并在C-末端加2 myc6His標簽,插入pTRE載體(Clontech 公司), 通過共轉染質粒pSV Hygro 進入tet-off MEF細胞株而建成. 用 200微克/毫升潮霉素（hygromycin）選擇被成功轉染的細胞.

用熒光激活細胞分選/Western/磷酸化酶聯(lián)免疫吸附試驗分析鑒定細胞株
用熒光激活細胞分選(FACS)/WESTERN/磷酸化的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定時, 將細胞置于有或無強力霉素的狀況下超過48小時, 然后以每孔750,000個細胞的濃度接種于6個10 cm的培養(yǎng)皿里, 并繼續(xù)在有或無強力霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。接種后24小時, 5 個培養(yǎng)皿用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次、然后把培養(yǎng)液換成含有0.1%FCS的DMEM。再過第24小時后加入0, 5, 50, 100, 和 200 ng IGF-（13769，Sigma, Hamburg, 德國），這些細胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時。次日, 去掉培養(yǎng)皿的上清液、用PBS 洗一次，把用胰酶消化的細胞與上清液混合在一起. 用離心的方法收集細胞并重新懸浮于500毫升PBS。取其中 250微升的細胞懸液、用甲醛固定, 用含有100微克/毫升核糖核酸酶H和25微克/毫升的碘染色PBS染色, 然后用FACSCalibur(流式細胞, 迪肯森,德國海德堡)進行分析. 剩余的細胞離心沉淀，用緩沖液A(20 mM TRIS pH8/135mM NaCl/1%NP-40/10%甘油/1.5mM層酸鈉)外加一片整套蛋白酶抑制劑(Roche, 德國曼海門)的溶液裂解。蛋白質含量測定采用Bradford 方法. 裂解液用ELISA和Western blot方法分析。ELISA 分析: 100微克蛋白質加到預涂有抗-myc(9E10)抗體的96孔板. Py-99抗體被用來檢測磷酸化的IGF-1R。Western-blot: 300 微克蛋白質涂抹到硝酸纖維素膜用抗-myc(9E10),、抗-IGF-1R,、抗-AKT1 和磷酸-AKT 抗體(全是1:200)檢測。

軟瓊脂和免疫熒光檢測細胞：
把細胞先培養(yǎng)在加有或無強力霉素的培基中至少48小時后，細胞才能進行軟瓊脂以及IGF-1R免疫熒光檢測。
軟瓊脂檢測:
細胞被包埋在含有DMEMFCS 4%瓊脂糖里, 并保持原來加或不加強力霉素的狀態(tài)、接種到涂有0.8%瓊脂糖培養(yǎng)皿上.
免疫熒光分析:
細胞被放在蓋玻片下, 用4%多聚甲醛固定并使細胞通、再用9E10抗體為第一抗體及用FITC標記的抗鼠抗體為第二抗體進行檢測、隨后用DAPI復染細胞核。

細胞磷酸化檢測:
細胞先在有或無強力霉素培基中至少培養(yǎng)48小時,然后被接種到48孔板里。在無血清饑餓18小時后, 加入經(jīng)二甲基亞砜連續(xù)稀釋后的化合物 (二甲基亞砜的最終濃度為1%)，培養(yǎng)90分鐘、隨后加入IGF-1作用10分鐘。然后，細胞被裂解,如同以上描述的進行ELISA檢測。顯示出最有力抑制IGF-1R磷酸化及其下游效應物AKT磷酸化的化合物，將被選為最有前景的先導化合物。

體內移植瘤活性的研究:
用29G針頭的注射器注射，在左側腹背部的皮下組織里注射0.2毫升含有4X107細胞。原發(fā)腫瘤的體積用肉眼檢查, 通過游離卡尺測量大小并乘以所有立體面的距離. 當原發(fā)腫瘤的體積達到約200立方厘米后, 開始用化合物/抗體治療或用強力霉素 (在含有1%蔗糖的飲用水里放2毫克/毫升)。在研究過程中, 動物的體重每周稱三次、每天監(jiān)測動物的行為。評價IGF-1R抗體抗腫瘤的活性的標準是腫瘤的消退.
完全消退(CR)—腫瘤消退到小于觸診的最低限度(<63毫米)
部分消退(PR)—腫瘤縮小超過50%(CR包括在PR內)
對于尿嘧啶標記的部分,剖檢前24小時,往動物的腹腔內注射100-200微升含有10微克/毫升尿嘧啶的無菌1XDPBS (BD Pharmingen).

在MEF/IGF-1R 腫瘤樣本里IGF-1R蛋白質的表達:
把腫瘤切成小塊,在Qiagen研磨混合器MM301里, 混與冰冷的溶解緩沖劑(1%Triton-X-100, 100mMNaCl, 10mMtris-HCl（pH7.5）, 1mMEDTA(pH8), 1mMEGTA(pH8), 1mMNaF, 20mMNa4P2O7, 1mMNa3VO4, 10%甘油,以及一片蛋白酶抑制劑. Roche 診斷, 曼海門,德國)。在4C進行2小時培養(yǎng)后, 腫瘤裂解物在4C下以16000g離心15 分鐘. 把上清液吸到一個放在冰浴里的新的干凈的管子里. 按照制造商的指示, 用Bradford進行總蛋白濃度的測定(BIO-RAD protein Assay). 這些腫瘤裂解物要儲存在-80C直到進行測定. 在腫瘤裂解物里, IGF-1R表達及AKT磷酸化可使用市售的酶聯(lián)免疫吸附試驗合, 按照廠商的說明進行測定(Dy391;R&DSystems, LilleCEDEX, 法國).

免疫組化:
從單個冰冷腫瘤里準備7微米冰凍切片, 并用4%甲醛固定.用酒精加3%H2O2固定內源性的過氧化物酶. 外源性的和總的IGF-1R則用生物素酰化的9E10抗體及隨后的鏈霉親和素和辣根過氧化物酶(PO)接合的抗兔抗體進行測定. TUNEL 和Brad U的染色則根據(jù)廠商的說明進行(分別是 Roche, 及 BD Pharmingen).