使用非洲蟾蜍提取物篩選Wnt-B-catenin 的信號通路的小分子抑制劑

2012年11月8日 | Filed under: 新藥研發(fā),推薦技術,文獻綜合 | Posted by: 朱貴東

基本原理和流程圖:

Wnt 信號通路的異常活化已被證明是與多種人類疾病,最明顯的是癌癥, 相關聯的. 這一通路的抑制劑的篩選幾乎完全使用培養(yǎng)的哺乳動物細胞. 眾所周知, 這可能會有人為的傾向及由于所用細胞株的基因背景而導致結果偏頗. 現在我們使用融合B-連環(huán)素和Axin 與螢火蟲及海腎熒光素酶, 實驗分別表明融合的蛋白質的表現類似于它們的野生型配對物. 使用這鐘雙熒光素酶的讀數, 我們改用非洲蟾蜍提取物系統(tǒng)來進行高通量篩選. 從這些結果表明信號分布曲線反應出抗體庫篩選的復雜性. 憑借這些結果, 我們可以合理推測其它胚胎途徑, 癌癥的失控.及用非洲蟾蜍卵提取物改變篩選抑制物/調制物.
附加工具: 以非洲蟾蜍為基礎的篩選能作為一種獨立的佐證工具來驗證從哺乳動物的篩選, 并獲得額外的信心.

方法:
化合物和重組蛋白
試劑– 3,6-二羥基,5,7-二羥黃酮, 兒茶素水合物, 放線菌酮均購自Sigma-Aldrich(圣路易斯, 密蘇里州). LRP6-ICD 象以前描述的那樣準備,但有輕微的改變. 8 種細菌的沉淀物用6M鹽酸胍變性, 組氨酸標記的LRP6-ICD 與鎳樹脂結合,然后用咪唑洗脫. 洗脫用透析方法去掉鹽酸胍. 所有的化學結構用CS ChemDraw Ultra 的方法提取. 除非另有說明, 二甲基亞碸在所有的實驗中用作所有化合物的載體.

在體外翻譯的蛋白質
按照產商的指示, 放射性標記的B-Catenin 和Axin生成于兔網織細胞裂解液(Promega 公司, 麥迪孫, 威斯康星州). 另外用于HTS的B-Catenin-FLuc 和 Axin-RLuc 亦根據產商的指示產生于ＴＮＴ　ＳＰ６高產蛋白表達系統(tǒng)（Promega）．

非洲蟾蜍卵提取物的準備：
所有的蟾蜍都在排卵前３－７天用１００U　孕馬血清促性腺激素激活（孕馬血清，Sigma公司）．　給予５００Ｕ人類絨毛膜促性腺激素誘導排卵．然后，每一只蟾蜍放在一個裝有約２升的Marc’s 改良林格氏液(MMR)（１００mＭNaCl, 2mM KCl, 1mMMgCl2, 2mMCaCl2, 0.1mMEDTA, 5mMHEPES(pH7.8).的大箱內，并讓其在１６Ｃ條件下排卵１２－１８小時，　再把蟾蜍移至另外的容器．把蟾蜍卵集中到一個燒杯內，用１６Ｃ的１ＸＭＭＲ液體洗三次以去除碎片．讓蛙卵沉淀，去除多余的緩沖液．然后溫柔旋轉，使蛙卵重新懸浮在一個含有２％半胱氨酸的ＭＭＲ液體里．膠樣外膜約５分鐘內開始溶解，并且當蛙卵完全沉淀在一起時完全溶解．用大量的１ＸＭＭＲ清洗蛙卵，直到緩沖液看上去不再混濁．蛙卵然后再用蟾蜍緩沖液（１０0 mM KCl, 0.1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM potassium HEPES(pH7.7),50 mM Sucrose）洗兩次．用大口塑料巴斯德吸量器把看上去是白色的蛙卵吸去因為這些細胞已死亡并可能汚染提取物．把蛙卵移到一個冷卻的３０毫升離心管．當卵子一沉淀就吸去多余的緩沖液．把這些蛙卵首先在ＳorvalRC-6里４度下用２００rpm離心２分鐘以進一步去除多余的緩沖液，４度下再用２１，０００g　粉碎性離心５分鐘以使提取物分離成三個主要層次．中間層含有細胞質．用一個p1000的塑料吸管頭通過在頂部脂質層打一個孔把這一層吸出再放進一個新鮮的，冷卻的３０毫升的管子，加入細胞松弛素Ｂ（１０微克／毫升）以防止肌動蛋白的聚合．提取物用２１，０００g離心，細胞質被轉移兩次．最終的提取物應該是淡黃色．蛋白酶抑制劑（１０００Ｘ貯存濃度，亮肽素，靡酶抑素，和胃蛋白酶抑制劑都是１０毫克／毫升于ＤＭＳＯ內）．能原組合（２０mM三磷酸腺苷, 150 mM 磷酸肌酸 2 mM EGTA, 20 mM 含水MgCl2 (pH7.7)）都被加入并混合，提取物被分裝，快速冷凍，儲藏在液氮里．這種提取物能保存B-Catenin 和Axin的降解活性一年以上．

３８４孔實驗條件：
把先前準備的提取物迅速解凍, 并置于冰上. 在體外翻譯(IVT)的B-Catenin-FLuc (1 毫升), Axin-RLuc (1.5毫升), LRP6ICD (400 nM) 被加入到100 毫升蛙卵提取物里, 并在4C下以從一端到另一端的轉動方式混合10 分鐘. 然后樣品由一個24 通道的重復吸量器人工地分進冷卻的384孔板(5微升/孔)并保持在4C冷藏室內直到需要加其它的化合物. 抗體庫化合物用針樣工具轉移進去(自定義的儀器, 哈佛醫(yī)學院)或用Echo550隔音板重新摸式化(Labcyte, 范德比爾特化學生物研究所)平板,在 25C 和2%DMSO條件下, 達到最終濃度范圍在40到200uM., 然后板子被封好, 輕輕渦旋,在25C培育4小時. 孵化后, 按照生產商提供的方法,用雙格洛熒光素酶檢測(Promega)螢火蟲和海腎熒光素酶活性. 在一個Envision平板閱讀儀(PerkinElmer, Waltham, MA)上或FDSS系統(tǒng)(Hamamatsu, Bridgewater, NJ)熒光信號被接受. 當需要稀釋時, 蛙卵提取物用蟾蜍緩沖液進行稀釋.

篩選統(tǒng)計學:
按照Malo等人的方法要點,我們正常化每一個平板. 在正常化程序中, 使用杜克的中位數去除以刪除系統(tǒng)性的行和列的偏差(例如, 邊緣效應). 找出Axin 和B-Catenin孔之間的正常化的板塊之間的不同(相當于非板塊規(guī)模的比例).如果在兩個復制物中板塊的強度差異經驗分布在5 - 95%之中,這個化合物就被確定.
如用克魯斯卡爾-沃利斯分析,數據轉化成Z-分數(Z=\frac{x-\mu}{\sigma}), 并用閾值的Z-分數(z <-3, z > 3, 及-3 < z > 3) 來分成三組(活化劑, 抑制劑, 和無活性化合物). 克魯斯卡爾-沃利斯分析的應用表明: 在這三組中,總數的平均值有著明顯的差異(p=1.07e-19).

報告分析:
以細胞為基礎的熒光酶檢測, HEK293 STF 細胞在次級融合水平被接種到96孔板, 并用穩(wěn)定格洛熒光素酶檢測儀(Progema)進行熒光酶活性測定.使用CellTiter-Glo 檢測儀(Promega)使熒光酶活性正常化到活細胞數量. 所有的圖表與非線性回歸都用Prism4（Graph Pad Software, 圣迭戈,加州）擬合成一個S型劑量反應曲線(可變的曲線).

細胞株:
HEK293 和IEC-6購自ATCC. 用標準的方法生產的一個HEK293 細胞株可在CMV(CMV-Luc)啟動因子的控制下穩(wěn)定的表達螢火蟲熒光酶.
細胞株被保存在DMEM及10%胚胎牛血清和抗菌素里.
除非另有說明, 細胞株被用化合物/或Wnt處理24 小時.

抗體和質粒:
用Alpha-B- 連環(huán)蛋白(BD 轉導實驗室, 富蘭克林湖, 新澤西)和Alpha – 微管蛋白(圣克魯斯生物技術, 圣克魯斯, 加州)抗體進行免疫印跡實驗. 以標準的PCR為基本的克隆方法并進一步克隆進pCS2載體產生B-Catenin-FLuc 和Axin-RLuc的融合,LRP6ICD 的細菌表達建立已在 8 描述過.

免疫印跡和免疫熒光:
免疫印跡– 細胞被溶解在非變性緩沖液(50mM Tris-Cl, pH7.4, 300mMNaCl, 5mMEDTA, 1%[w/v]Triton X-100). 可溶性的部份用于免疫印跡.
免疫熒光– 細胞被點在涂有纖維連接蛋白涂層的蓋玻片上, 用3,7%的甲醛固定, 染色, 放進備有DAPI的VectaShield (媒介實驗室). 用一個裝在尼康Eclipse 80i熒光顯微鏡上的CoolSNAP ES攝像機的60X或100X 的放大物鏡來拍攝圖像..

非州蟾蜍的研究:
非州蟾蜍在體外受精, 去膠樣外膜, 保存和注射如前所述. 化合物溶解在100%DMSO中. 測試復合物沐浴實驗: 胚胎被培養(yǎng)在MMR中,化合物按照指定的濃度加入.在第10期, 胚胎用大量的MMR 洗三次,以清除殘留的化合物. 按照生產商的說明, 用MESSAGE 機器, 一層層的B-Catenin FLuc 和 AxinRLuc mRNA就生成了.

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