一個強(qiáng)大的高通量篩選胚胎腫瘤細(xì)胞的分化和生存的化學(xué)調(diào)制

2012年11月8日 | Filed under: 新藥研發(fā),推薦技術(shù),文獻(xiàn)綜合 | Posted by: 朱貴東

應(yīng)用：癌癥（癌癥干細(xì)胞抑制劑/分化劑）和神經(jīng)學(xué)/組織再生（干細(xì)胞生存誘導(dǎo)）

原理：
理清管理干細(xì)胞的自我更新，分化或死亡的命運(yùn)選擇的復(fù)雜的相互作用，向科研人員提出了一個嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。以圖像為基礎(chǔ)的現(xiàn)象驅(qū)動的篩選通過提供快速的多個小分子同時被檢測的手段而符合這種挑戰(zhàn)。在這種篩選中,多能的胚胎癌（EC）細(xì)胞提供了一個方便的胚胎干細(xì)胞(ES)替代品，因?yàn)樗鼈冎恍枰唵蔚木S護(hù)和控制。作者開發(fā)了一種基于圖像的篩選試驗(yàn)，通過測量細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞表達(dá)一個多能性相關(guān)的標(biāo)記SSEA3的比例的效果，以確定能影響人類EC干細(xì)胞株NTERA2的生存或分化的化合物. 80個激酶抑制劑的試點(diǎn)篩選確定了幾個改善細(xì)胞的生存或誘導(dǎo)分化的化合物。這些生存化合物能強(qiáng)烈抑制這些激酶的ROCK和PRK2. 突出了這些激酶在EC細(xì)胞的存活中的重要作用。故而猜測這些抑制劑可能在組織再生和神經(jīng)系統(tǒng)中是重要的工具。兩個其他的分子，GF109203X和rottlerin，誘導(dǎo)EC的分化和抑制ES細(xì)胞的自我更新能力，導(dǎo)致細(xì)胞周期停止，壓抑多能性相關(guān)基因的表達(dá)。這些分子可能是強(qiáng)有力的癌癥干細(xì)胞抑制體的前體。

方法：

胚胎癌和胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)
NTERA2 cells3如同以前所述的保存在杜爾貝科的改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM培養(yǎng)液; Invitrogen公司，佩斯利，英國），輔以10％小牛血清（FCS;
胎牛血清，ThermoScientific，Cramlington，英國）在37°C及含10%二氧化碳的空氣中. 3種人類胚胎干細(xì)胞系(ES)被用于這項(xiàng)研究. 它們是shef4，Shef5，Shef6，10和H7.1 所有的ES細(xì)胞都被保持以集落形式在不能分裂的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞上(MEFs). 細(xì)胞培養(yǎng)在含有KnockOut
DMEM培養(yǎng)液（KO-DMEM; Invitrogen）, 輔以20％的KnockOut血漿置換（Invitrogen），1mM L-谷氨酰胺（Invitrogen公司），0.1mMβ-巰基乙醇（Sigma-Aldrich公司，普爾，多塞特，英國），1×非必需的氨基酸（Invitrogen公司），和4 ng / mL的基本成纖維細(xì)胞生長因子（FGF; Invitrogen公司）, 并置于37℃，含5％的二氧化碳空氣中。

化合物:
用于主要篩選的化合物庫是蛋白激酶抑制劑庫（生物分子，恩佐生命科學(xué)，
英國埃克塞特; http://www.biomol.com）。全反式維甲酸和DMSO購自
Sigma-Aldrich公司。

抗體
以下的主要單克隆抗體是從預(yù)先滴定的雜交瘤的上清液在自己的實(shí)驗(yàn)室制備的:
MC631(anti-SSEA3), 11 MC813-70（anti-SSEA4），12 TRA-1-60，13和
P3X63Ag8.14兔多克隆抗OCT4（ab19857-100; Lot no. 138154）抗體購自Abcam（劍橋，英國）。使用的次要抗體是Dylight-594-結(jié)合的山羊抗大白鼠IgM抗體，μ鏈特異性抗體（112-515-075; Lot no. 82183; Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA）, 熒光素結(jié)合的山羊抗小白鼠IgG（115-095-003;批號52637;Jackson ImmunoResearch），或Dylight-488-結(jié)合的驢抗兔IgG抗體（711-485-152;Lot no.88371;Jackson, ImmunoResearch）作為適當(dāng)?shù)闹饕贵w的亞型.
主要和次要的篩選試驗(yàn)
為篩選化合物，NTERA2細(xì)胞接種在96孔μclear平底板,每孔2500
細(xì)胞（格雷納Bio-one，斯通豪斯，英國）。每個化合物進(jìn)行了三種不同濃度（0.1，1和10μM）的測試，而且是每種濃度一式三份.
井。每個平板中有9個孔含有0.1％DMSO（載體）作為對照，3孔含10微摩爾全反式維甲酸作為分化對照。5天后，細(xì)胞用無Ca2 +和Mg2 +的
Dulbecco的磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗一次，然后用4％多聚甲醛固定
15分鐘。隨后是洗滌細(xì)胞并在加有10％FCS（封閉液）的PBS中封閉
1小時。細(xì)胞然后與主要抗體SSEA3 在一起培養(yǎng)1小時.之后用PBS洗三次，并在一種與FIT C結(jié)合的第二抗體中孵育1小時。平板上至少有三個
孔的細(xì)胞僅僅與第二抗體在一起培養(yǎng)過.以此確定背景熒光。細(xì)胞核用10微克/毫升赫斯特33342（Invitrogen公司）進(jìn)行復(fù)染色。染色細(xì)胞的圖像
使用自動顯微鏡平臺而獲得（InCell分析1000年，GE醫(yī)療，小Chalfont
英國）。使用10×目鏡從每孔獲得10個隨機(jī)視野。使用開發(fā)工具箱1.7軟件（GE醫(yī)療）對圖像進(jìn)行分析。來于主要篩選中的點(diǎn)擊的效果用與主要篩選相同的程序重復(fù)試驗(yàn)化合物在0.1，1，2.5，5，10μM的最終濃度進(jìn)行證實(shí).
Z'因子評估
Z'因子是一個無量綱參數(shù)用來評估篩選試驗(yàn)成功與否/.15性能計(jì)算Z'因子，
在一個96孔的板中，30孔的細(xì)胞經(jīng)0.1％DMSO處理作為細(xì)胞分化的陰性對照..另30孔細(xì)胞用10μM的全反式維甲酸處理作為細(xì)胞分化的陽性對照。在SSEA3陽性細(xì)胞的比例按前面所述進(jìn)行確定。使用下列公式計(jì)算Z'因子
：1 - [（3 * SD（陰性對照）+3 * SD（陽性對照）/（平均值（陰性對照） - 平均值（陽性對照）]。

細(xì)胞生長的實(shí)驗(yàn)
對于EC和ES細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)，在rottlerin（0.3-10μM）存在,或有0.1％DMSO載體對照的情況下, NTERA2或Shef4分別以2500或6000個細(xì)胞種植于96孔平板的每孔. 經(jīng)過5天，細(xì)胞用PBS洗,并用4％多聚甲醛固定15分鐘。用PBS洗滌后，原子核是由10微克/毫升赫斯特33342（Invitrogen公司）染色而可視化和使用InCell Analyzer 1000(GE Healthcare)成像.
克隆形成實(shí)驗(yàn)
在涂有基底膜(Matrigel BD公司，牛津大學(xué)，英國; KO-DMEM培養(yǎng)液1:25稀釋）的6孔板進(jìn)行檢測。 H7型細(xì)胞用0.1％DMSO（對照組）或5μM rottlerin進(jìn)行預(yù)處理24小時，然后用胰蛋白酶處理后進(jìn)行收獲.
用培養(yǎng)液洗一次，使細(xì)胞重新懸浮在mTESR
培養(yǎng)液（StemCell Sciences，Palo Alto，CA），每孔分別種植10 000個細(xì)胞. 經(jīng)過7天，用4％多聚甲醛固定細(xì)胞. 染色用Hoechst 33342（Invitrogen公司）。通過InCell Analyzer1000（GE Healthcare）使平板成像.
使用Developer Toolbox（GE Healthcare）軟件從圖像進(jìn)行菌落數(shù)計(jì)算. 菌落形成效率用7天后菌落的數(shù)目和細(xì)胞種植的數(shù)目的比例來計(jì)算.
流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志
用胰蛋白酶（Invitrogen公司）分離細(xì)胞,并重新懸浮在封閉緩沖液（PBS輔以10％胎牛血清）。然后，5×105個細(xì)胞與一個主要抗體一起培養(yǎng)30分鐘。用封閉液洗滌三次后，細(xì)胞用與FITC結(jié)合的第二抗體標(biāo)記30分鐘。
隨后用封閉緩沖液洗滌細(xì)胞三次.,在CyAnADP氧氣流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter公司，布雷亞，CA）上分析細(xì)胞熒光。FITC陽性的標(biāo)準(zhǔn)是僅僅和第二抗體一起培養(yǎng)過的對照細(xì)胞或與來于母體骨髓瘤細(xì)胞系P3X63Ag8的陰性對照抗體一起培養(yǎng)過的細(xì)胞

BrdU細(xì)胞周期分析
5'-溴-2'-脫氧尿苷（尿嘧啶;Sigma-Aldrich）的結(jié)合被用來確定細(xì)胞增殖。 shef4細(xì)胞用不同濃度的rottlerin或0.1％DMSO（載體控制）處理24小時。然后這些細(xì)胞在20μM尿嘧啶中跳動2小時，用PBS洗，之后用胰蛋白酶（Invitrogen公司）處理并收獲。 PBS洗滌后，細(xì)胞被固定在
70％的乙醇里，并儲存在-20°C過夜。用PBS洗滌細(xì)胞兩次,然后孵育在1.5毫升0.2毫克/毫升胃蛋白酶（Sigma-Aldrich公司）里45分鐘。隨后細(xì)胞用0.1 M的四硼酸鈉（Sigma-Aldrich公司）洗兩次，用PBS洗一次。細(xì)胞用抗BrdU抗體（Dako公司，Glostrup，丹麥）標(biāo)記45分鐘. 之后用PBS洗兩次，與FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG +M第二抗體（Invitrogen公司）在4C培養(yǎng)45分鐘。用加有1％胎牛血清的PBS洗滌3次后,細(xì)胞用
20μg/ mL的RNA酶A（Sigma-Aldrich公司）處理30分鐘，然后重懸于
在含1％胎牛血清和10μg/ mL的碘化碘（PI; Sigma-Aldrich公司）的PBS里。青色的ADP與氧氣光學(xué)儀的流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter）用于分析細(xì)胞的熒光。

Annexin V(膜聯(lián)蛋白質(zhì)V-FITC) 檢測細(xì)胞凋亡
shef6細(xì)胞生長在六孔板用0.1％DMSO（對照組），或者含有5微摩爾rottlerin，或10微摩爾rottlerin的完全培養(yǎng)液里。每種條件都用一式三份培養(yǎng)孔。在一個18 h的培養(yǎng)后，收獲分離的或貼壁的細(xì)胞,并集中從每個孔里收集到的細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)離心沉淀，用PBS洗一次，再用結(jié)合緩沖液（10 mM肝素鈉，140 mM氯化鈉，氯化鈣2.5毫米，pH值7.4）洗一次，然后在室溫下在黑暗中孵育在20μL膜聯(lián)蛋白V-FITC（Invitrogen公司）里20分鐘。碘化碘(PI;10微克/毫升; Sigma-Aldrich公司）添加到每一待測的樣本, 然后細(xì)胞熒光在CyAnADP O2流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter公司）測量。

PCR定量
根據(jù)制造商的指示，使用RNeasy Mini試劑盒（Qiagen公司，克勞利，英國）提取總RNA。然后根據(jù)制造商的說明,用SuperScript II逆轉(zhuǎn)錄酶（Invitrogen公司）從1微克RNA合成cDNA第一鏈。PCR定量是在含有1×SYBR綠色JumpStart Taq的準(zhǔn)備預(yù)混（Sigma-Aldrich公司）和4 pmoles的正向和反向引物的20μL的反應(yīng)中進(jìn)行。反應(yīng)在iCycler iQ上運(yùn)行（Bio-Rad公司，Hercules，CA）。每個樣品一式三份進(jìn)行了測試,
GAPDH的表達(dá)用于樣本的規(guī)范化。RT-PCR和qPCR引物序列是從發(fā)表的研究報告或用Primer3方案（http://frodo.wi.mit.edu/primer3）從目標(biāo)序列選定的。
用TaqMan低密度陣列卡實(shí)時定量分析:
為了評估m(xù)RNA的相對表達(dá)水平，使用了一個TaqMan人類干細(xì)胞多能性的陣列（TLDA）卡（Applied Biosystems公司，靈頓，英國）。根據(jù)制造商的指示, 使用高容量的cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Applied Biosystems公司）, 使RNA被轉(zhuǎn)錄到cDNA. 在TLDA卡的每個端口上裝有含有1×的TaqMan通用預(yù)混（Applied Biosystems公司）和相應(yīng)于100 ng總RNA的cDNA的100μL的反應(yīng)盒。在相同TLDA卡上, 每個樣品進(jìn)行了一次重復(fù)測試。用ABI 7900（Applied Biosystems公司）采用熱循環(huán)。基因表達(dá)的相對定量用ΔΔCTmethod計(jì)算. 16β-肌動蛋白被用來作為內(nèi)源性對照以使樣品正常化，載體對照樣品（0.1％二甲基亞砜）是為相對量化校準(zhǔn)的。如果基因擴(kuò)增的CT值> 36 (即表達(dá)水平很低), 則被排除在分析外。

定量細(xì)胞的三磷酸腺苷
根據(jù)制造商的指示, 使用ATP測定試劑盒（Invitrogen公司）對細(xì)胞中總?cè)姿嵯佘眨ˋTP）進(jìn)行量化。簡言之，Shef6胚胎干細(xì)胞與5μM的rottlerin，10μM的rottlerin，或0.1％二甲基亞砜一起孵育2小時。用胰蛋白酶在
37℃作用3分鐘以收獲細(xì)胞，在ES培養(yǎng)液中洗一次,用PBS洗兩次。細(xì)胞顆粒在0.1 M的NaOH / EDTA中在60°C，40分鐘被溶解。然后，200μL預(yù)熱至100°C的Tris-EDTA添加到細(xì)胞裂解液并煮開2分鐘。接下來，10μL細(xì)胞裂解液放置在一個96孔板的孔里，通過加入90μL熒光素酶溶液使反應(yīng)開始。光發(fā)射立即使用光學(xué)板閱讀儀（BioTek, potton，英國）進(jìn)行測量。根據(jù)制造商的指示, 使用BCA分析（ThermoScientific）測定蛋白質(zhì)的濃度, 以計(jì)算細(xì)胞數(shù)目在不同處理之間可能存在的差異.