以流式珠為基礎的高通量多通路篩選小分子GTP酶抑制劑

2012年11月8日 | Filed under: 新藥研發(fā),推薦技術,文獻綜合 | Posted by: 朱貴東

應用：腫瘤
基本原理：
小GTP酶是細胞活性的關鍵調(diào)節(jié)分子，并是人類疾病特別是腫瘤中應用小分子抑制劑的新型治療靶點。本實驗手冊描述了一個多通路的，以流式細胞珠為基礎的實驗來鑒定并確認小GTP酶的抑制劑或激活劑。六種不同的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)換酶標記的小GTP酶被綁定在谷胱甘肽的珠子上，每個都貼上了不同紅色熒光強度的標簽。隨后，含有不同GTP酶的珠子將和被試的化合物一同混合并加入384孔板中，被熒光標記的GTP將被讀出。這種新型的多通路實驗將有助于實驗者篩選大約200,000種化合物，同時確認多于1200種的陽性化合物，以便下一步采用6-8通路的實驗，進行深入地劑量反應的分析。當假陽性及假陰性的化合物被去除后，少數(shù)幾個小分子家族的對抗GTP結(jié)合活性的化合物被鑒定出來。

方法：
試劑及細胞系：
BODIPY-FL-GTP 2′-(or-3′)-O-(N-(2-aminoethyl) 尿烷，G-12411，延長的金抗褪色試劑從Invitrogen分子探針公司購買(Eugene, OR)。比色的G-LISA實驗試劑盒用來定量Rac1/2/3的活性，羅丹明，鬼筆環(huán)肽，抗Rac1的單克隆抗體，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)換酶標記的GTP酶（包括：野生型的Cdc42, Rac1, RhoA, H-Ras及其活性突變體Cdc42Q61L, Rac1Q61L, RhoAQ63L, H-RasG12V）從Cytoskeleton, Inc. (Denver, CO)公司購買。GST-Rab2, GST-Rab7已經(jīng)純化，Mouse TruBlort? Ultra:鼠抗IgG的辣根過氧化物酶從eBioscience, Inc. (San Diego, CA)公司購買。Rac抑制劑NSC23766從Tocris Bioscience (Ellisville, MO)公司購買，EHT1864由A. Kornienko博士(New Mexico Institute of Mining & Technology)提供。多通路實驗的珠子是由Duke Scientific Corp. (Fremont, CA)公司合成的，但現(xiàn)在也可通過Thermo Fisher公司訂購。其它的試劑均可從Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)購買。鼠啫堿性的白血病2H3 (RBL) 細胞，Swiss 3T3細胞及IgE抗體是由B. Wilson (University New Mexico)博士提供。

多通路初篩
為了多重分析微量GTP酶, 我們采用了7種不同程度紅色的直徑4微米谷胱甘肽珠。每個聚苯乙烯玻璃粉裝置規(guī)格為1.4 × 105 beads/μL ,每個玻璃粉大約1.2 × 106個谷胱甘肽單位(用綠色熒光蛋白)。準備蛋白結(jié)合時,240-250μL 的每個玻璃粉裝置被各自密封,在0.1%的牛血清白蛋白NP-HPS 緩沖液(0.01%體積比的NP-40, 30 mM HEPES pH 7.5, 100 mM KCl, 20 mM NaCl)中并含有1 mM EDTA (NP-HPSE),室溫下放置30分鐘。離心分離后收集玻璃粉裝置,在100μL NP-HPSE 中重懸浮,然后分別用1 μM 已配好的GST-GTPase(Rab2 wt, Rab7 wt, Cdc42 wt, H-Ras wt, Rac1 wt, and Rac1Q61L mutant) 4度過夜培養(yǎng)。每個成對GTPase 玻璃粉用100μL 冰溫的NP-HPSE 緩沖液沖洗兩次,并補充0.1% BSA 和 1 mM dithiothreitol (DTT),然后冰浴保存在離心管中。把成對的GTPase 玻璃粉快速混合后,在每個健康的實驗平板上裝入5微升該混合物,然后將0.1微升的檢測化合物(1 mM stock in DMSO)加入到各平板中,在把5 μL BODIPY-FL-GTP (200 nM stock in NP-HPSE)加入到各平板中后,最后的化合物濃度達到10μM 和1%DMSO 。陽性對照包含了珠混合物,0.1微升DMSO,和熒光GTP, 放在每個平板的1 號和2號，陰性對照包含了玻璃粉混合物和熒光GTP,0.5mM無標記的GTP作為競爭,還有1%DMOSO, 都被單獨分析。用100 nM BODIPY-FL-GTP來演示這個實驗，是有一個Kd范圍在10到30nM的G蛋白.因為在3到10倍Kd下，演示實驗，當1小分子濃度在10 μM時可以注意到50%的抑制，這就是3到10 倍Kd 的價值。在Z的價值的基礎上，20%的最低限度的抑制力可以用2-6M范圍內(nèi)Kd值檢測出來盤子（玻璃板）放在旋轉(zhuǎn)器上在4攝氏度的情況下溫育40-45分鐘。樣品分析是用如之前描述的大流量細胞計數(shù)來做的。細胞計數(shù)的量少量散射（分散）而且以530 ± 20 nm (FL1) and 665 ± 10 nm (FL8)及665 ± 10 nm (FL8)發(fā)射熒光，被收集到青二氫磷酸氨的細胞計數(shù)的流量上（Beckman Coulter, Fullerton, CA）384個好盤子的篩檢需要花費15分，完全的文庫篩檢可以在8周內(nèi)完成。用IDLQuery軟件決定化合物在小孔的活性，結(jié)果按時間數(shù)據(jù)來分析。以FS和SS為基礎的參數(shù)被使用于識別單線態(tài)珠的數(shù)量。以FL8排放為基礎，區(qū)別于涂有不同蛋白質(zhì)的珠子，而且計算每個珠子的中值熒光。如果在活躍時改變較大，然后20%來自于基線，則次化合物被稱作蛋白激活分子。基準線被定在以100%測量值為基礎，測量值來自于包含正調(diào)控的1%DMSO，在數(shù)據(jù)庫做進一步描述。

劑量反應的測量值
在初篩上經(jīng)進一步分析鑒定，待測化合物是從混合存儲板中擇優(yōu)挑選出來的，然后從10mM的初始濃度連續(xù)的按1:3稀釋8次，產(chǎn)生9點稀釋階梯。本實驗最終的濃度范圍從10nM到100μM。如前所述，小珠在復用初篩部分被涂上一層蛋白質(zhì)。我們可以使用1 多倍儀來進行劑量反應分析(Rab7 wt, Rab2 wt, H-Ras wt, H-RasG12V, Cdc42 wt, and Cdc42Q61L)和3 單一鏡像。(Rac1 wt, Rac1Q61L, and GST-GFP)。在包含鎂的實驗中，我們使用含1mM的MgCl2 NP-HPS緩沖器。8 GST-GTPases在一個單一多倍儀(Rac1 wt, Rac1Q61L, Rac2 wt, RhoA wt and RhoAL63, Cdc42 wt, Cdc42Q61L and Ral wt)中同時被鑒定，而且100nM BODIPY-FL-GTP粘合物在存在或缺少一系列藥物稀釋系列中被測量。每個劑量反應系列被一分為三。

動力學分析
野生型GST-Cdc42 (4 μM)在4°C下被束縛在GSH-beads一夜。在30°C下20 分鐘，包含緩沖器的10 mM EDTA，在GSH-beads上的 Cdc42被核苷酸耗盡，用NP-HPS緩沖液洗兩次，然后懸浮在含有1 mM EDTA, 1 mM DTT, and 0.1% BSA的同樣的緩沖液中。動力學分析顯示，用DMSO (1%最終濃度)或者10 μM MLS000532223孵化50μL的GST-Cdc42-GSH-bead懸浮液2分鐘，隨后添加50 μL的冰冷的各種濃度的 BODIPY-FL-GTP。在動力學模式下，使用FacSCAN流動細胞計數(shù)器測量聯(lián)合熒光核苷酸。此項目平均數(shù)是150per s。使用IDLQuery（免費從作者那獲得軟件）將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成ASCII格式。使用GraphPad Prism軟件輸出策劃未加工的數(shù)據(jù)。

Rac激活實驗
在細胞基礎實驗中，Swiss 3T3細胞總是通過MLS000532223來監(jiān)控Rac1抑制。細胞一晚血清餓死，然后用1% DMSO（負調(diào)控）或在10 μM DMSO（1%最終濃度）化合物處理20到30分鐘。當正調(diào)控時，用10 ng/mL表皮生長因素（EGF）處理2分鐘。細胞溶菌作用，免疫沉淀反應的積極Rac1，用GST-PAK-PBD固化在GSH珠，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，如上所述免疫印跡。

活化Rac的G-LISA?實驗
按照標準流程對Swiss 3T3細胞進行饑餓培養(yǎng)(Cytoskeleton, Inc., Denver, CO)。在6-well dishes的個體培養(yǎng)用濃度范圍在0.1到10μM的MLS000532223孵化一個小時，隨后用10 ng/mL EGF刺激2分鐘。細胞用冰冷的PBS沖洗，PBS包含鈣，鎂和深層加工的蛋白質(zhì)和G-LISA?實驗。正調(diào)控包括工具箱提供的Rac1-GTP和細胞溶解產(chǎn)物，由只用EGF控制刺激的細胞制備。

活細胞顯微鏡
活細胞顯微鏡用來觀察RBL-2H3 細胞。細胞在蓋玻片上生長一夜，用Tyrode緩沖液清洗，覆蓋(10 mM HEPES [pH 7.4], 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.4 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5.6 mM glucose, and 0.1% BSA)。在37°C下在100分鐘內(nèi)每隔60秒加入10 μM MLS000532223（最終濃度）后，拍攝時滯圖片。配合基刺激中，用1 μg/mL 2,4-二硝基酚 (DNP)–BSA。用Bio-Rad 輻射2100聚焦顯微鏡，裝備有一個60 × 1.4 NA油浸物鏡，物鏡配備有 lasersharp3000軟件。

熒光免疫檢驗法著色和顯微鏡
RBL-2H3細胞在載玻片上生長和培養(yǎng)一夜，在10 μM MLS000532223存在或者缺少情況下。當正調(diào)控時，如前所述細胞被1 μg/mL DNP-BSA刺激30分鐘。細胞用PBS清洗，用3% 的多聚甲醛固定，用0.1%的Triton X-100在Tyrode緩沖液中透化五分鐘，用1% BSA在Tyrode緩沖液中阻礙一小時，然后再用若丹明-鬼筆環(huán)肽染色一小時。所有的繁殖均在室溫下。在成像來看，使用Prolong gold anitifade 試劑使樣品在載物玻片上增加。一個A Zeiss LSM 510 顯微鏡，40×的物鏡，被用于收集圖像。

β-己糖胺酶分泌物測量
為了檢測β-己糖胺酶的釋放量,細胞用免疫球蛋白E包被在24孔板中隔夜培養(yǎng)。IgE培養(yǎng)的細胞在臺式緩沖液中用已經(jīng)濃度的抑制劑沖洗和培養(yǎng)一個小時，等份試樣(100μL)的細胞培養(yǎng)上清液用來分析自然釋放的X的量。將細胞暴露在1 μg/mL DNP-BSA的臺式緩沖液中， 37度處理30min, 使細胞活化。β-己糖胺酶的釋放量如 Ortega等人的描述的方法進行計算。其值根據(jù)采用的1% Triton X-100的臺式緩沖液的不同，計算總量中β-己糖胺酶的百分比。

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