基于全細胞熒光分析的DPP1抑制劑篩選

2012年11月8日 | Filed under: 新藥研發(fā),推薦技術(shù),文獻綜合 | Posted by: 朱貴東

潛在應(yīng)用：COPD （慢性阻塞性肺病）

基本原理:

二肽基肽酶(Dipeptidyl peptidase 1 , DPP1) 是一種溶酶體木瓜蛋白酶家族的半胱氨酰蛋白酶參與細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解，并且是慢性阻塞性肺病的較感興趣的靶點。目前，僅有離體的DPP1酶活性分析，主要方法是用合成的底物如二肽或肽連結(jié)到氨基-甲基-香豆素或其他熒光基團上。然而，目前還沒有簡易的基于全細胞的分析方法檢測溶酶體DPP1活性除了使用基于侵入性活性探針或生理的產(chǎn)物如中性粒細胞彈性蛋白的產(chǎn)生。體外重組酶活性分析存在一定缺點。作者研究了許多DPP1熒光底物，探討了作為進入溶酶體增強體內(nèi)檢測DPP1酶活性的潛在可能性。這個實驗方案主要介紹一種簡易的非侵入性的使用底物H-Gly-Phe-AFC檢測新鮮的或冷藏保存的人THP-1細胞中DPP1活性熒光分析。這種基于細胞的熒光分析方法可以在96孔板中進行操作并可作為理想的適合檢測細胞DPP1抑制劑。

方法:

材料
所有分析試劑及細胞生長所用培基購買于 Sigma-Aldrich，H-Gly-Phe-AFC購于NeoMPS, Polypeptide Laboratories Group (San Diego, CA)，H-Gly-Arg-AMC購于Bachem (Bubendorf, Switzerland)。 (Gly-Arg)2-rhodamine 合成于 Medicinal Chemistry Department at AstraZeneca R&D Charnwood (Loughborough, UK) ，一個 GSK DPP1 抑制劑專利 WO 2006094003。Human recombinant DPP1 (hrDPP1)生產(chǎn)于DECS Group at AstraZeneca R&D (M?lndal, Sweden)。

培養(yǎng)和冷凍保存的THP-1細胞
THP-1 人單核粒細胞性白血病細胞，來自于 American Type Culture Collection (TIB 202 F-11838; ATCC, Manassas, VA) 。生長條件是RPMI + 1% (v/v) glutamine + 10% (v/v) fetal calf serum (FCS) ，37°C ，5% CO2 培養(yǎng)箱。在合適的生長密度，收集THP-1細胞并重懸于PBS中(pH 7.4) 。冷凍的THP-1細胞密度約為1.0 × 107/mL，凍存條件為 80% (v/v) of FCS, 10% (v/v) DMSO, and 10% (v/v) 生長培基 (RPMI) ，?150°C。在分析之前，凍存的細胞于37°C 水浴復(fù)蘇，300 g 離心5分鐘，去除凍存液，以合適密度重懸于PBS中。新鮮的或凍存的細胞要求有95%以上的細胞活力，用 Cedex cell counter檢測 (Trypan blue uptake)。

DPP1 酶活性分析
重組人DPP1酶活性分析主要檢測氨基-甲基香豆素或氨基-氟香豆素底物肽釋放出的酶活性，氨基-甲基香豆素熒光密度Ex λ350 nm 和Em λ450 nm，氨基-氟香豆素 Ex λ400 nm 和 Em λ505 nm。檢測過程在黑色384孔板中，終體積為50 μL，溫度為22°C。分析條件包括：assay buffer (25 mM piperazine buffer, pH 5.0; 50 mM NaCl, 5 mM dithiothreitol [DTT]; 0.01% [v/v] Triton X-100), 100 μM H-Gly-Arg-AMC or H-Gly-Phe-AFC (~equivalent to Km), and hrDPP1 (~0.1 nM)。化合物溶解于DMSO中并稀釋在分析緩沖液里，使得DMSO終濃度為1% (v/v)。以10為底的半對數(shù)稀釋方法稀釋抑制劑，用4參數(shù)logitic非線性擬合方程計算pIC50 。標準的非可逆選擇性DPP1抑制劑(vinyl sulfone [VS])作為該分析方法的陽性對照。常規(guī)來說，在加入底物肽之前，先把化合物與重組DPP1預(yù)孵育30min，再開始反應(yīng)，然后放置于22°C孵育60min。此后，空板迅速置于熒光讀板儀上，使用合適的激發(fā)光和發(fā)射光波長讀數(shù)。用基于Michaelis-Menten的方程計算底物Km 。

DPP1 細胞分析
該分析在 96孔板中進行 (Corning Costar; Corning, Lowell, MA)。10 μL 分裝的化合物 (10-point half-log concentrations) 或 10 μL 5% (v/v) DMSO 陽性對照或 10 μL VS (final assay concentration [FAC], 10 μM) 陰性對照加到合適的孔中。隨后加入 30 μL 1.0 × 106/mL PBS重懸的 THP-1 細胞加到所有孔中。置于37°C 細胞培養(yǎng)箱中孵育60 min ，加入10 μL H-Gly-Phe-AFC (FAC 100 μM ~equivalent to Km) 開始反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物在熒光孔板讀數(shù)儀上讀數(shù)Spectramax Gemini (Molecular Devices, Sunnyvale, CA; Ex λ400 nm, Em λ505 nm)。在實驗過程中，細胞活力要求降低程度<5%。化合物的pIC50用4參數(shù)logitic非線性擬合方程計算。標用基于Michaelis-Menten的方程計算底物Km 。許多蛋白酶或溶酶體抑制劑，如bafilomycin A1, cystatin, elastase, cathepsin L, and cathepsin K都可以用來做THP-1細胞DPP1分析。作為對照，另外兩個底物(Gly-Arg)2-rhodamine 和 H-Gly-Arg-AMC可用上述方法在THP-1細胞中進行，(Gly-Arg)2-rhodamine熒光檢測條件為Ex λ485 nm and Em λ535 nm。

用H-Gly-Phe-AFC在THP-1細胞中進行DPP1成像
該分析在 96-well Biocoat collagen type 1 板中進行(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)。在100μL的體系中，分析成分包括 10 μL H-Gly-Phe-AFC (FAC 100 μM), 10 μL of DraQ-5 dye (FAC 2 μM; Biostatus, Leicester, UK), 10 μL of DMSO (FAC 1% [v/v]), 70 μL PBS重懸的THP-1 (i.e., final 56K cells)。孔板置于 ImageXpress 5000a (MDS Analytical Technologies, Sunnyvale, CA)成像。用20× PF ELWC objective抓拍圖像。DraQ-5 作為細胞核marker 區(qū)別于熒光信號 H-Gly-Phe-AFC。 DraQ-5 使用λ700-75 nm 發(fā)射濾光片λ620-60 nm 激發(fā)λ660 nm long-pass (LP) 分色鏡成像。DraQ-5 曝光時間為 250 ms.。H-Gly-Phe-AFC成像用λ535-50 nm發(fā)射濾光片, λ360-40 nm 激發(fā)，λ505 nm LP分光鏡，曝光時間為150 ms。H-Gly-Arg-AMC成像用類似條件抓拍。 Hoechst 33342 作為細胞核marker在下面的采集過程中是使用：發(fā)射濾光片λ460-50 nm，激發(fā)為λ360-40 nm, λ400 nm LP 濾光片, 曝光時間為50 ms. H-Gly-Arg-AMC 成像發(fā)射濾光片為λ620-60 nm，激發(fā)為λ570-20 nm, λ585 nm LP 分光鏡及100-ms 曝光時間。

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