噬菌體展示技術(shù)篩選單鏈抗體的方法

2012年11月8日 | Filed under: 新藥研發(fā),推薦技術(shù),文獻(xiàn)綜合 | Posted by: 朱貴東

這是綜合匯編并驗(yàn)證修改的方法。對(duì)于具體項(xiàng)目，可作相應(yīng)的修改。
1. 細(xì)菌宿主細(xì)胞的準(zhǔn)備:

在新的篩選過程開始之前, 從凍箱中取出TGI 細(xì)胞, 接種到M9 小量瓊脂培養(yǎng)平板. 在37 c 中培養(yǎng)一個(gè)晚上, 然后把平板密封閉并儲(chǔ)存在4c 冰箱里。在含50 ml 2x YT 液體的250 ml 的燒瓶里接種單個(gè)克隆的TGI細(xì)胞( 在每一次篩選中, 至少需要10 毫升細(xì)胞培養(yǎng)液. 如果需要的話, 可接種更多的燒瓶).

另一種方法: 在篩選前一天, 接種10 毫升單克隆TGI 細(xì)胞到一個(gè)50 毫升的Falco 管，在37 度中以280 轉(zhuǎn)/分的速度旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)過夜。在進(jìn)一步洗脫噬菌體之前約3 小時(shí),把50 毫升2xYT加入含有250 微升經(jīng)過一夜培養(yǎng)的TGI 細(xì)胞液，并把它放到37 度中離心(280轉(zhuǎn)/分)培養(yǎng)，用OD600 控制其生長(zhǎng)。當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)達(dá)到中等對(duì)數(shù)期(OD600=0.5-1.0, 約5x108細(xì)胞/毫升)時(shí), 馬上使用這個(gè)培養(yǎng)液.要不然, 把這個(gè)培養(yǎng)液放在冰里直到需要把噬菌體提出進(jìn)行感染 (6.1 章) 或是滴定(7.2及 7.3 章).

2. 抗原的準(zhǔn)備:

在DDI 過程中使用已定的程序, 詳細(xì)記錄在此次項(xiàng)目中使用過的所有抗原和對(duì)照抗體.

2.1 生物素標(biāo)記抗原

按照產(chǎn)品提供的步驟用Sulfo-NHS-LC-Biotin 反應(yīng)計(jì)(Pierce 21335) 生物素標(biāo)記約100微克抗原。我們的目的是使每個(gè)抗原接合2 個(gè)生物素。在反應(yīng)中用超過10 倍克分子濃度的生物素反應(yīng)計(jì)算, 并用去鹽旋轉(zhuǎn)柱去除沒有反應(yīng)的生物素。用生物素定量測(cè)定器材來確定生物素比抗原的比例。只有生物素酰化超過1,且抗原溶解低于總數(shù)的20% 的抗原才被認(rèn)為合格。如果生物素標(biāo)記不合要求, 應(yīng)重新生物素標(biāo)記，并適當(dāng)調(diào)整生物素酰化計(jì)的克分子濃度。
質(zhì)量控制:
把生物素標(biāo)記的及非生物素標(biāo)記的抗原排列在 (1) PAGE: 觀察降解及聚集;(2) 8 個(gè)一組: 觀察其與鏈霉敏感性的特異結(jié)合; (3) 用任意的一種抗原特異性功能或結(jié)合的測(cè)試來觀察不變的功能.
生物素標(biāo)記的抗原用于 5.1.3 章.

2.2 固相涂層抗原微孔板篩選

抗原涂層飽和度測(cè)試采用ELISA應(yīng)用Maxisorp 或類似的高結(jié)合平板做的。試驗(yàn)準(zhǔn)備11 個(gè)抗原用PBS 做2 倍稀釋(從 10 微克/毫升稀釋到0.01微克/毫升);每一種稀釋度三個(gè)樣品,另外加對(duì)照(無或用不相關(guān)的抗原),每個(gè)樣品50 微升稀釋液，在4度培養(yǎng)一個(gè)晚上。封閉微孔板, 用相應(yīng)的第一、二、抗體來檢測(cè)抗原.如果可能的話, 可用一系列的商品化的抗體來檢測(cè)不同的表面抗原決定簇。注意不同抗原的飽和度范圍.如果在最高濃度時(shí)看不到ELISA 的飽和度信號(hào), 可試用其它非PBS 的緩沖劑, 同時(shí)應(yīng)重復(fù)飽和度的測(cè)試過程。
涂層-每一次篩選,（不同噬菌體抗體庫或?qū)嶒?yàn)條件）, 每孔涂200微升飽和濃度的抗原, 并在4度下過夜。用300微升4% 脫脂奶粉封閉微孔板，室溫1 小時(shí)，然后用PBS 緩沖液清洗。這種涂了抗原并封閉好的微孔平板用于5.2 章.

3. 準(zhǔn)備噬菌體抗體庫:
在篩選的所有步驟中使用相同的封閉液。
封閉液:
篩選生物素標(biāo)記抗原用含有4% BSA (Sigma, A7030) 的 PBS-LT (0.01% Tween 20, PBS)
固相篩選用用含有4%脫脂奶粉的PBS-LT (Bio-Rad 170-6404)

3.1第一輪篩選:

把噬菌體抗體庫的抗體, 按50μL（1E12）等份分裝，每次用一管，不要把抗體庫混合到一起。把所用的那管抗體簡(jiǎn)單的離心一下，把抗體加入裝含有150 微升4% 封閉液的1.5毫升 Eppendorf 管中進(jìn)行封閉，室溫下放置1 小時(shí)，取10微升用于輸入滴定.

另外一種方法:
抗體庫中所有的抗體 (Kappa & Lambda) 都按約150微升(1E12)分裝。每次篩選時(shí)，從每個(gè)抗體庫中取出相同劑量進(jìn)行混合。取一管簡(jiǎn)單離心后，把 Kappa 和 lambda的抗體庫混合在一起, 并加入PBS 到800 微升，再加入200 微升PEG/NACL, 在冰中放置 30 分鐘。然后在4 度中用24000xg 離心 10 分鐘，小心緩慢地盡可能地吸去除上層漂浮液，然后在 1.5 毫升Eppendorf 管內(nèi)用吸量器吸動(dòng)，使沉淀物重新懸浮到200微升4% 封閉液，室溫下放置 1 小時(shí)，千萬不要用旋渦器，最后取出10微升用于輸入滴定。

3.2 余下的篩選步驟:
把50微升2 次 PEG 沉淀的噬菌體(6 章) 混合到 150 微升4% 封閉液;室溫下培養(yǎng)1 小時(shí);取 10 微升用于滴定.

4.抗體庫的準(zhǔn)備:
在所有的篩選步驟中, 用相同的固定液.
固定液:
篩選生物素酰化的抗原: 用PBS-LT(0.01%Tween 20,PBS) 含有4% BSA (Sigma, A7030).

固相篩選: PBS-LT (BioRad, 170-6404) 加有4%脫脂奶粉.

4.1, 篩選的第一步:
. 把抗體庫等分為50微升(1E12)一份. 每一份用于每一個(gè)篩選, 不要混合抗體庫.
. 簡(jiǎn)單離心每一份抗體庫.
. 在 1.5毫升Eppendorf 管加150微升4%固定液. 再加入抗體庫以固定抗體庫.
. 在室溫下培養(yǎng) 1小時(shí).
. 取10微升用作輸入滴定.

另一種方法是:
把 Kappa 和 Lambda 抗體庫都等分為150微升(約為1E12). 每一次篩選用從每個(gè)抗體庫混合的一份.
. 簡(jiǎn)單地離心每份抗體庫.
. 混合Kappa 和Lambda抗體庫, 再加PBS 到800微升.
. 加200微升 PEG/NaCl, 然后在冰上培養(yǎng)30分鐘.
. 24000xg 4C下離心10分鐘.
. 小心緩慢地盡可能地去除所有的上清液.
. 在1.5毫升Eppendorf管里用吸量器重新懸浮沉淀物到200微升4%固定液.
. 室溫下培養(yǎng)1小時(shí).
. 取10微升作輸入滴定.

4.2. 篩選的隨后步驟:

. 混合50微升雙重PEG-沉淀的噬菌體(來于6章)到150微升4%固定液.
. 室溫下培養(yǎng)1小時(shí).
. 取10微升作輸入滴定.

5.0 篩選

5.1 用King Fisher 液相篩選
5.1.1. 封閉用鏈霉包裹的磁性珠子(Dynabeads) 來取消選擇和篩選.
每一個(gè)篩選用50 微升磁珠
. 在原有的容器內(nèi)用旋渦器混合珠.子
. 吸 50 微升珠子到Eppendorf 管, 放入磁柱并去掉儲(chǔ)存時(shí)的緩沖液.
. 用1毫升 PBST 清洗, 洗3 次. 即: 用吸量器使珠子重新懸浮, 讓磁柱
收集珠子并去掉清洗液.
. 把洗過的珠子重新懸浮到200微升4%的封閉液(相同于封閉噬菌體抗體的
液體).
. 在搖動(dòng)器上室溫培養(yǎng)一個(gè)小時(shí).
. 用手輕彈管子以便收集管底的液體.
. 把整管的懸浮液加到磁柱里以收集磁珠和去掉封閉液.
. 用50 微升PBS-LT 重新懸浮磁珠.

5.1.2. 在King Fisher 平板去除抗體庫的選擇 (為去除磁珠特異性的噬菌體)
. 把干凈的管子放入磁柱, 加入25 微升封閉的磁珠.
. 去除緩沖液,加入200 微升封閉的抗體庫并用吸量器混合.
. 把混合的液體倒在 King Fisher 平板A 行.
. 在 King Fisher 平板的B行倒入200微升PBS-LT.
. 進(jìn)行去除選擇的程序( 混合 1 小時(shí), 把磁珠轉(zhuǎn)移到B行).
. 從A行收集去除選擇的抗體庫, B行的磁珠丟棄.

5.1.3. 在 King Fisher 平板中篩選

每一柱( 有8 個(gè)孔) 只用于每個(gè)單一的篩選過程,從平板中去掉沒有用的柱.
用 Trypsin 洗脫 (CATtryp 抗體庫) 和用 HCL 洗脫( Dyax 抗體庫) 程序的篩選分別使用不同的平板.
. 混合 25 微升封閉的磁珠和175 微升PBST, 并放入平板B 行.
. 分別加200微升PBST 到C 行和D 行.
. 分別加 200微升PBS-LT 到E, F, 及G 行.
. Ｈ行空著，直到King Fisher 篩選項(xiàng)目需要時(shí)．
．把去掉選擇性的抗體庫（５．１．２章）及１５pmol　生物素酰化的抗原混合（３．１　　章），然后加進(jìn)Ａ行．
．把平板放入King Fisher 儀器，并按照其指示（同時(shí)也附在此文件中，用第一個(gè)SoluSolid_HCLTrp 程序來做篩選的第一步．根據(jù)需要，用第二個(gè)或者第三個(gè)SoluSolid_HCLTrp　程序來做篩選的

其它步驟．
．為洗脫CATtrp抗體庫,用０．１Ｍ的磷酸鈉（pH=7）稀釋（１：５００）冰凍的Trypsin　部分．然后馬上加到平板的H 行.
. 在H 行洗脫噬菌體.
. 小心! 用HCL(Dyax 抗體庫洗脫噬菌體的程序結(jié)束后需要馬上進(jìn)行中和.
. 取10 微升用于輸出滴定.
. 把洗脫的噬菌體儲(chǔ)放在冰里直到準(zhǔn)備擴(kuò)充.
(*) 磁珠的最大結(jié)合能力取決于抗原的大小. 25 微升磁珠最多能結(jié)合16.6 pmol IgG 或50 pmol 生物素酰化的肽鏈(縮氨酸). 15 pmol 150KD 蛋白質(zhì)是22微克, 15 pmol 15 KD 蛋白質(zhì)是0.22 微克, 15pmol/200 ul 是75nM.
5.2. 用微平板進(jìn)行固相篩選
. 把封閉的抗體(4 章) 加入到涂有抗原的單個(gè)孔里, 并封閉微平板(3.2 章).
. 在室溫下靜止?fàn)顟B(tài)培養(yǎng)1小時(shí).
. 用PBS 人工手洗培養(yǎng)孔5 次, 再用PBS-LT 洗5次.
. 用新鮮配制并稀釋的Trypsin 洗脫CATtrp 抗體庫噬菌體(200 微升,10微克/毫升, 30 分鐘, 37C). 用兵HCL 洗脫Dyax 抗體庫(200 微升, 0.1M HCL, 5 分鐘在室溫,然后移到加有65微升, 1M Tris pH=8 的Eppendorf管中.
. 取10 微升用于輸出滴定.
. 存于冰中直到準(zhǔn)備進(jìn)行感染指(6 章).

6. 洗脫噬菌體的擴(kuò)充

6.1. 篩選物劃碟 – 第1 天(即篩選的同一天, 5 章)
. 把100 微升TGI細(xì)胞培養(yǎng)液涂到培養(yǎng)皿中作為沒有感染的細(xì)胞對(duì)照.
. 把全部洗脫的噬菌體(5章)放入50 毫升Falcon 管里, 加10微升TGI 細(xì)胞培養(yǎng)液 (2 章), 在37C 中緩慢搖動(dòng)150 轉(zhuǎn)/分 1 小時(shí).
. 用70微升感染的TGI 細(xì)胞做克隆挑選僅用于第2和第3步的篩選步驟.
. 把Falcon管里余下的細(xì)胞在2500 轉(zhuǎn)/分離心15 分鐘.
. 用 2 毫升2XYTCG(2X YT+100 微克/毫升卡苯尼西林及2%葡萄糖) 重新懸浮沉淀物. 然后把細(xì)胞涂于2XYTCG BioAssay 瓊脂平板.
. 把100 微升無感染的TGI 細(xì)胞對(duì)照涂在2XYTCG 小培養(yǎng)皿上.
培養(yǎng)過夜后,這個(gè)培養(yǎng)皿應(yīng)該沒有細(xì)胞生長(zhǎng).
. 把所有的培養(yǎng)皿置于30 C 過夜.

6.2. 篩選物的擴(kuò)充 – 第二天
. 用細(xì)胞刮刀把細(xì)胞從BioAssay瓊脂平板上刮下, 并用強(qiáng)烈的旋渦方式把細(xì)胞重新懸浮與加有10毫升2XYTCG的50 毫升管里.
. 取2 個(gè)800 微升的細(xì)胞懸液放于標(biāo)記好的低溫管中, 再加400微升50% 的甘油.混合之后把這些加有甘油的儲(chǔ)備細(xì)胞置于-80C(篩選物的備用品).
. 找出細(xì)胞懸浮液的OD600(要精確的測(cè)定OD600, 必須充分稀釋樣品, 使測(cè)定值保持在0.06-0.6 之間).
. 把細(xì)胞接種到裝有50 毫升2XYTCG 的250 毫升燒瓶里. OD600 在開始時(shí)應(yīng)在0.05-0.1 之間,
. 把細(xì)胞培養(yǎng)在37C 280轉(zhuǎn)/分使OD600 達(dá)到0.5-1.0 的范圍.
. 從這種細(xì)胞培養(yǎng)中取10 毫升加到預(yù)熱在37C 的50毫升管子里, 丟掉剩余的.
. 在MOI=20 時(shí),加入輔助噬菌體(M130K07 用于Dyax, M13K07trp 用于CAT 抗體庫). 當(dāng)OD600 =0.5 時(shí),加5E10 噬菌體到10 毫升TGI 培養(yǎng)液.
. 在150 轉(zhuǎn)/分的緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)中繼續(xù)37C培養(yǎng)一小時(shí).
. 用2000xg離心10 分鐘.
. 盡量去除并丟棄上清液, 用吸量器在1毫升2XYTCK(2XYT+100微克/毫升卡苯尼西林和50微克/毫升卡那霉素里重新懸浮沉淀物.
. 把1 毫升細(xì)胞接種到裝有25毫升2XYTCK 的250毫升燒瓶里. 在25C中用 280轉(zhuǎn)/分生長(zhǎng)過夜.

6.3. 收獲及凈化擴(kuò)充的噬菌體—第三天
. 把細(xì)胞培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到一個(gè)50 毫升管中并在冰中稍微冷卻,
. 用實(shí)驗(yàn)臺(tái)上(小)離心機(jī)在4C下以4750轉(zhuǎn)/分離心30分鐘. 如果上清液是混濁的, 把它轉(zhuǎn)入另一個(gè)干凈管子里并重復(fù)這一步驟.
另一種方法是用地面(大)型離心機(jī)在4C下以8000轉(zhuǎn)/分離心20 分鐘.
. 把20毫升上清液(不要攪動(dòng)細(xì)胞沉定物)轉(zhuǎn)入到另一個(gè)新的50毫升管里, 加5毫升PEG/NACL 混合, 然后在冰中培養(yǎng)一小時(shí).
. 在4C下用4750轉(zhuǎn)/分離心15分鐘.
. 小心地去除所有的上清液.
. 加1毫升PBS-LT, 用吸量器重新懸浮沉淀物. 然后轉(zhuǎn)入Eppendorf管.
. 4C下用24000xg離心10分鐘, 以去掉殘留的細(xì)菌.
. 取800微升上清液于200微升PEG/NACL混合. 在冰中培養(yǎng)15分鐘.
. 4C下4000xg離心10分鐘以收集噬菌體.
. 小心吸去并丟棄所有的上清液.
. 用吸量器使沉淀物重新懸浮于0.1毫升PBS-LT中并轉(zhuǎn)入另一新的Eppendorf管.
. 4C 下24000xg離心10 分鐘以去掉剩余的沉淀物.
. 把上清液裝入一新的管子里. 這就是雙重PEG-沉淀的噬菌體,用于4.2.章.

7. 測(cè)定篩選的輸入和輸出

7.2 的方法是用于測(cè)定輸入和輸出滴定. 由于輸入滴定相當(dāng)高,輸入噬菌體必須象7.1. 描述的那樣稀釋.
7.3.的方法用于在第二及第三輪篩選之后做克隆的挑選

. 篩選輸入滴定: 用PBS-LT 稀釋 10 微升封閉的噬菌體(4 章, 含有約5E10 cfu), 3 次乘以系數(shù)100 (10 微升+ 990微升->10 微升+990微升->10 微升+990微升, 加10 微升(約5E04 cfu)到A 列(7.2 章).
計(jì)算輸入滴定用 7.2 章的公式, 再用得數(shù)乘以1E06. 這就是噬菌體cfu在190 微升篩選所用的封閉的抗體庫中(4章)的數(shù)量.
*例如, 有5個(gè)噬菌體在G 列, 輸入噬菌體的滴定就是1.95E06(5*380*4-5)輸入抗體滴定應(yīng)是1.95E12,

7.2. 一個(gè)培養(yǎng)皿滴定的方法:

這個(gè)方法用于在96 孔平板中最多有12個(gè)噬菌體樣品的滴定.
稀釋液被點(diǎn)進(jìn)一個(gè)單一的大的瓊脂培養(yǎng)皿. 每一個(gè)滴定有84倍稀釋, 從2E08到4E02之間的滴定都包括了.
. 稀釋平板, 用低容量, 象PCR, 96孔培養(yǎng)板.
, 用盡量多的柱 (1-12), 如果你有很多噬菌體需要數(shù).
B-H 列每孔加15 微升PBS-LT. 加10微升噬菌體裁(5.1.3, 5,2, 及 7.1.章)