用HTS 篩選組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑

2012年11月8日 | Filed under: 新藥研發(fā),推薦技術(shù),文獻(xiàn)綜合 | Posted by: 朱貴東

主要適應(yīng)范圍: 抗白血病的后生癌癥藥物

基本原理和流程圖: 實(shí)驗(yàn)胚胎的畸變正引起越來(lái)越多的關(guān)注,因?yàn)樗赡苁窃诎┌Y發(fā)展中的關(guān)鍵因素..
近來(lái), 組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶的不正常已與幾種類型的癌癥聯(lián)系起來(lái)了. 單核細(xì)胞白血病鋅指蛋白(MOZ)是組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶MYST家族中的一個(gè)成員.MYST酶系通常調(diào)節(jié)基因在細(xì)胞增殖和分化的表達(dá). MOZ組成的活化引起白血病干細(xì)胞的形成,使得MOZ成為一個(gè)極好的治療髓細(xì)胞性白血病的指標(biāo).這個(gè)程序表達(dá)了一個(gè)有力的同質(zhì)化測(cè)驗(yàn)來(lái)測(cè)量合成的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶的組蛋白肽底物的乙酰化. 初步篩選是要找出抑制劑, 而二級(jí)反篩則是用于消除干擾檢測(cè)的化合物, 從而進(jìn)一步證實(shí)抑制劑.

方法和程序:
. 蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化: 人類MOZ的MYST 片段(507-778 殘基)是通過(guò)一個(gè)N-終端融合蛋白質(zhì)與E.coli衍生的NusA溶解性標(biāo)記連接于一個(gè)His6. 通過(guò)鎳固定的金屬離子親和層析(Ni-IMAC)進(jìn)行蛋白質(zhì)純化. 為了產(chǎn)生一個(gè)pNusA-His^-hMOZ表達(dá)載體, 一個(gè)cDNA序列編碼這些不同的區(qū)域, 通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增. 使用的引物有側(cè)翼5’Ncol 和3’Notl雙酶切點(diǎn). 然后克隆到一個(gè)pETM60衍生的載體里. 如果使用表面等離子體共振(SPR)實(shí)驗(yàn), 人類MOZ來(lái)于MYST區(qū)域(殘基497-780)被表達(dá)為一個(gè)N-終端His6融合的蛋白質(zhì)(從結(jié)構(gòu)基因組學(xué)聯(lián)盟獲得, 同意號(hào)D12-APC027).同樣, 對(duì)于SPR實(shí)驗(yàn), 人類MYST來(lái)源的MOZ區(qū)域(殘基 177-447)被表達(dá)為一個(gè)連接N-終端His 6-標(biāo)記的融合蛋白. 為了產(chǎn)生pHis6-hMOF表達(dá)載體, 把側(cè)翼有5’Ncol 和3’Notl 雙酶切點(diǎn)的引物用PCR擴(kuò)增這兩個(gè)區(qū)域并克隆進(jìn)一個(gè)pProEXHTa 載體(Invitrogen, 卡爾斯巴德, 加州).
. 為進(jìn)行蛋白質(zhì)的生產(chǎn),pNusA-His6-hMOZ. pHis6-hMOZ 及 pHis6-hMOF表達(dá)的載體被轉(zhuǎn)化進(jìn) E.coli BL12(DE3)細(xì)胞. 把這樣產(chǎn)生的菌株培養(yǎng)在一個(gè)10升大的布勞恩Biostat B 發(fā)酵瓶,并用0.1mM異丙醇1PTG誘導(dǎo)在15C過(guò)夜.

. 為高通量篩選而進(jìn)行NusA-His6-hMOZ的純化
一個(gè)37克(濕重)的大腸桿菌細(xì)胞沉淀物被重新懸浮在200毫升裂解液(25mM Tris (pH8), 500mMNaCl, 0.02% 疊氮化鈉,0.01% Triton-X100, 5%甘油, 10mM 咪唑,5mM 二硫蘇糖醇(DTT), 加上蛋白酶抑制劑片(Roche,Basel,),20 微升 Benzonase (Merck, whitehouse Station,新澤西州), 100 毫克溶菌酶(Sigma, St.Louis,密蘇里州)). 細(xì)胞在冰上攪拌1小時(shí),然后讓細(xì)胞通過(guò)一個(gè)Avesstin C5細(xì)胞勻漿器以15,000psi 3次進(jìn)行機(jī)械性溶解. 由此產(chǎn)生的細(xì)胞裂解液用48,000g離心20分鐘. 上清液用5微米過(guò)濾器過(guò)濾. 這種NusA-His6-hMOZ蛋白質(zhì)然后在一個(gè)5毫升HisTrap柱上利用Profinia蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)(Bio-Rad, Hercules, 加州)純化. 隨后是兩步凝膠過(guò)濾步驟,先是一個(gè)Superdex 200 26/60 柱, 然后是一個(gè)Superdex 75 16/60別(GE, 醫(yī)療). 總的說(shuō)來(lái), 用這種方法從37 克E.coli沉淀物最后在最終緩沖液(25mM Tris(pH8), 500mMNaCl, 0/02%疊氮化鈉, 5%甘油, 及,5mM DTT) 里生產(chǎn)出約15毫克純化的NusA-His6-hMOZ蛋白質(zhì). pCAF酶購(gòu)自Millipore(比爾里卡,馬薩諸塞州).

. 小分子抗體庫(kù)
WEHI 93K HTS 和CRC-CTx 153K HTS 的抗體庫(kù)用于這個(gè)實(shí)驗(yàn). 其實(shí)任何其它的小分子化合物抗體庫(kù)既使有些適當(dāng)?shù)淖儺愐部梢允褂? 簡(jiǎn)言之, 從不同的產(chǎn)商淘汰鉛樣化合物, 而其它化合物85% 以上類似于任何其他產(chǎn)商, 按照Tanimoto系數(shù)進(jìn)行判籪并進(jìn)一步考慮去除. 采用功能組過(guò)濾器以消除活性化合物. 額外的檢測(cè)干擾過(guò)濾器用于CRC-CTx 153K HTS抗體庫(kù)最終步驟之前. 化合物溶解在干凈的DMSO, 并以5mM的濃度儲(chǔ)存在可控氣壓條件下(TTP LABTECH 化合物, 墨爾本, 英國(guó))

. HAT 活性:
不同酶的HAT活性測(cè)定使用以AlphaScreen 為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法(珀金埃爾默, 馬薩儲(chǔ)塞州沃爾瑟姆). 這個(gè)試驗(yàn)反應(yīng)在 384 孔低容量檢測(cè)板以8微升的容量進(jìn)行(格雷納, Frikenhausen, 德國(guó)或康寧,洛厄爾, 馬薩諸塞州). 反應(yīng)在檢測(cè)緩沖液(100 mM Tris-HCL (pH7.8), 15mM NaCl, 1mM EDTA, 0.01%Tween-20, 1mM　ＤＴＴ，及０．０２％Ｍ／Ｖ雞蛋白蛋白)里進(jìn)行. 除非另有說(shuō)明, 反應(yīng)用 15ｕＭ　ＡｃＣｏＡ（Ｓｉｇｍａ），５０ｎＭ　Ｎ－終端組蛋白Ｈ４肽鏈(序列SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKV-GGK-生物素, Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司)．１０ｎＭＭＯＺ酶及乙酶-賴胺酸-特異性抗體(ａ－ＡＣＫ（最終稀釋度1:3500）細(xì)胞信號(hào)技術(shù), 丹佛斯,ＭＡ;ａ－Ｈ４ＡＣＫ８－１(最終稀釋度 50納克/毫升)，Ａｂｃａｍ, 英國(guó)劍橋; ａ－Ｈ４ＡＣＫ８－２(最終稀釋度 1:3000)　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司).
. 在第一步的HTS試驗(yàn)中,15納升抗體庫(kù)化合物被干撒在從第1到第22列的測(cè)試板. 而第23和24列則加入同等量的DMSO. 使用這些準(zhǔn)備好的測(cè)試平板允許化合物儲(chǔ)存中心在底物和酶被快速不斷地添加進(jìn)去之前能進(jìn)行較大批量的準(zhǔn)備和運(yùn)輸.

. 對(duì)于隨后的試驗(yàn), 用DMSO進(jìn)行抗體庫(kù)化合物的11 點(diǎn)稀釋系列.在加入酶啟動(dòng)反應(yīng)前, 100ｎＬ容量被一針型工具加進(jìn)含底物的測(cè)試平板. 在所有的平板上都要進(jìn)行陽(yáng)性(無(wú)底物)及陰性(AｃＣｏＡ去除)對(duì)照反應(yīng), 并如同化合物處理的反應(yīng)孔,用相同劑量的DMSO.

. 在加入所有的試劑后, 平板用粘合劑密封, 然后室溫下培養(yǎng)60分鐘. 4微升額外的緩沖液(含有最終濃度為4微克/毫升的AｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ受體珠及鏈霉親和供體珠(珀金埃爾默))被加入, 培育5 小時(shí)后,用一個(gè)ＥｎＶｉｓｉｏｎ２１０３多標(biāo)記平板翻譯儀按照HTS AｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ模式進(jìn)行讀取(珀金埃爾默). 每一個(gè)抗體庫(kù)化和物的抑制百分比相對(duì)于每個(gè)平板的陽(yáng)性和陰性對(duì)照基礎(chǔ)上計(jì)算出來(lái).

. 滴定試驗(yàn)
IC50 值取決于恰當(dāng)?shù)囊种瓢俜直扰c化合物的濃度(雙重的11點(diǎn)稀釋) 對(duì)一個(gè)4參數(shù)的計(jì)算方式.
. 監(jiān)督檢測(cè)質(zhì)量: Z 因子測(cè)定

滴定CｏＡＳＨ－它不溶于DMSO里.在測(cè)定緩沖液里加入20 ｍＭ的原液. 取0.5微升加入反應(yīng)孔. 對(duì)于某些試驗(yàn),ＴｒｕＨｉｔｓ珠(珀金埃爾默)被用于測(cè)定對(duì)檢測(cè)方式的干擾.

. 輻射的測(cè)定:
HAT的活性及小分子的抑制活性基本上象以前描述的那樣用輻射試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定. 簡(jiǎn)言之, 用1.5微克重組的組蛋白H3.3和H4 (Nｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ，　Ｂｉｏｌａｂｓ，　Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ) 與120納克純化的NｕｓＡ－Ｈｉｓ６－ｈＭＯＺ融合再一起在HAT 緩沖液里(50ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）．５０ｍＭＫＣｌ，　０．１ｍＭＥＤＴＡ，　５％甘油,１ｍＭＤＴＴ)培養(yǎng). 加0.125微居里ａｃｅｔｙｌ－１－１４Ｃ－ＡｃＣｏＡ（珀金埃爾默）, 使得總?cè)莘e為30微升,在30C培養(yǎng)30分鐘. 加進(jìn)額外的Lａｅｍｍｌｉ緩沖液, 并在10% Bｉｓ-Tｒｉｓ（２－３）聚丙烯酰胺凝膠電泳（ＰＡＧＥ）解析每一種反應(yīng)的一半之前煮沸5 分鐘以終止反應(yīng). 在凝膠被Pｈｏｓｐｈｏｒ篩選前要干燥24-48 小時(shí). 然后使用富士的FLA-3000成象儀(富士, 東京, 日本)成象. 此外, 在干燥前, 用SａｆｅＳｔａｉｎ把蛋白質(zhì)在電泳中的痕跡染色進(jìn)行可視化加載.兩種圖象用IｍａｇｅＪ(國(guó)家衛(wèi)生研究院, 貝塞斯達(dá), 馬里蘭州)進(jìn)行定量. 對(duì)于相關(guān)的蛋白信號(hào)而言, 14碳信號(hào)是標(biāo)準(zhǔn)..

. 用生物感應(yīng)表面等離子體共振測(cè)定化合物的特征.

用一個(gè)BiacoreT 100系統(tǒng)(GE Healthcare)進(jìn)行化合物結(jié)合特征的測(cè)定

按照制造商的建議, 用一個(gè)基本的胺偶合鏈霉親和素并固定到一個(gè)CM5芯片上.靶蛋白質(zhì)MOZ及一個(gè)對(duì)照蛋白質(zhì)被1:1 克分子比例的磺酸基-NHS-LC-LC-生物素(ThermoScientific,羅克福德,IL)有限標(biāo)記,測(cè)定其非特異結(jié)合, CSF1-R激酶的結(jié)構(gòu)區(qū)域.用體積排除色譜從非混合試劑里純化這些蛋白質(zhì),成并固定在泳動(dòng)的緩沖液里(50mM HEPES (pH7.5), 150mM NaCl, 10mM MgCl, 5mMDTT, 0.05%Tween-20, 5% DMSO). 在鏈霉親和素芯片表面, 在4C和100uM濃度時(shí), 化合物被分別注射進(jìn)這些點(diǎn)里. 除了溶劑校正外,參考通道的信號(hào)被從蛋白質(zhì)通道的信號(hào)里減去. 用洗滌軟件(www.biologic.com.au)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析.

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