適用于篩選其它的粘合劑（結(jié)合劑）

2012年11月8日 | Filed under: 新藥研發(fā),推薦技術(shù),文獻綜合 | Posted by: 朱貴東

篩選流程圖:

. 重組靶蛋白Bcl-2的制備(首先是GST-融合, 然后是無GST的蛋白)
. 篩選噬菌體庫
. 分離過緊的粘合劑
. DNA測序以確定粘合劑序列
. 通過酶聯(lián)免疫吸附試驗進行親和力的估計.

材料:
. 大腸桿菌株 BL21(DE3)被用于生產(chǎn) Bcl-2 蛋白的表達宿主
. 細菌培養(yǎng)基, 胰蛋白胨和酵母提取物都購自Difco (碧迪公司, 富蘭克林湖,新澤西州)
. M13肽庫篩選試劑盒 (博士噬菌體表達肽庫試劑盒)從新英格蘭Biolabs (富康,麻州)購得.
. 抗M-13單克隆抗體, 多克隆谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST), 抗Bck-2 及抗-Bax 這些特異性抗體都購于圣克魯斯生物技術(shù)(圣克魯斯, 加州)
. 所有其它的化學品, 包括異丙基-1-半乳糖苷(IPTG)則購自Sigma (圣路易斯,密蘇里州).

GST融合蛋白的純化:
重組Bcl-2(rBcl-2)蛋白質(zhì)的產(chǎn)生和純化如同在其它地方描述過的一樣. 簡單的說, 把Bcl-2蛋白質(zhì)的成熟形式進一步克隆到pGEX-4T-2質(zhì)粒(Amersham生物科學公司,皮斯卡塔韋, 新澤西州)內(nèi)EcoR1和Xho1 的位置(pGEX-4T2-Bcl2), 這樣就使得靶蛋白被表達成GST-融合蛋白. 質(zhì)粒然后被轉(zhuǎn)化進BL21(DE3) E.coli菌株, 培養(yǎng)在含有100微克/毫升氨芐青霉素的1升Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基在37C下, 直到OD600 達到0.7. 然后通過加入0.5mM IPTG 繼續(xù)在37C下培養(yǎng)4-5小時以誘導細胞超表達靶蛋白. 用離心收獲細胞, 產(chǎn)生的沉淀在-80C過夜. 重新懸浮細胞于10毫升磷酸鹽緩沖液(PBS, 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 2mM KH2PO4, pH7.4). 然后置于4C, 用溶菌酶處理, 攪拌30-60 分鐘,再用超聲波處理. 之后, 4C下用15,000g離心15分鐘. 用0.45微米的注射器過濾器過濾去除不溶性的顆粒. 剩下的上清液被裝進預先用PBST(PBS 含0.5%TritonＸ-100)緩沖液平衡的GST瓊脂糖凝膠柱(Ａmersham 生物科學). 凝膠柱隨后用至少三倍柱容量的PBST緩沖液洗. 之后用五倍柱容量的PBS洗以去除多余的ＴritonＸ-100. Bcl-2被用20ｍＭ谷胱甘肽，０.15ＭNaCl，５０ｍＭTris（ｐＨ８.0）以線性梯度洗脫,含有靶蛋白的部分被收集并通過鹽柱以去除谷胱甘肽.

制備無GST的蛋白:
根據(jù)制造商的說明(Sigma公司), 無GST的Bcl-2(ｒBcl-2)用凝血酶處理的方法產(chǎn)生. 加入1ｍＭ　苯甲脒以終止裂解反應. 無GST蛋白用一個離子交換柱, 單Q(Amersham 生物科學)及0.5MＮaCl線性梯度及25ｍＭ Na-phosphate，ｐＨ7.4 去鹽柱純化. GST-Bcl-2的裂解采用兩個不同的能特異性的分別識別GST-標記(抗-GST)和Bcl-2-標記（抗-Bcl-2）的抗體的西方印跡方法證實.

噬菌體肽庫的篩選:
博士-12噬菌體表現(xiàn)出的2.7X109肽復雜性的肽庫(PhD12, 新英格蘭生物實驗室公司)被用于篩選. 0.5微克純化的Bcl-2蛋白被通過疏水作用固定在聚苯板孔里, 然后用2%牛血清蛋白(BSA, 2%牛血清白蛋白于含50mMTris-HCl[pH7.5],150mM NaCl, 0.1%Tween-20的Tris-緩沖的鹽水[TBST])在室溫下復蓋1小時. 這些孔用TBST洗三次, 再用于生物篩選. 一個特定量的噬菌體被加入孔里,在室溫下輕輕搖動培養(yǎng)一小時. 然后用TBST 洗這些孔10次.結(jié)合的噬菌體在化學洗脫液里洗脫(0.2M甘氨酸[pH2.2],1毫克/毫升BSA). 洗脫物馬上用1M Tris-HCl[pH9.1]中和. 在隨后的幾輪生物篩選(第2- 第5 輪中, TBST里的洗滌劑或鹽的濃度增加如下: 0.3%Tween-20(第2輪),0.5%Tween-20(第3輪),0.5%Tween-20 加500mMNaCl(分別為第4和第5輪). 在最后一輪時, 加入額外數(shù)量的Bcl-2蛋白使結(jié)合的噬菌體被洗脫. 從每一輪洗脫的噬菌體用E.coli ER 2738株進行擴增以便隨后的生物篩選有足夠的復制本. 在繁殖5小時后, 用11,000g離心15 分鐘以去除細菌細胞. 按照制造商提供的程序, 培養(yǎng)上清液用聚乙二醇(20%[W/V]聚乙二醇-800和2.5M NaCl) 沉淀部分純化了噬菌體.用10,000rpm 速度離心愛30 分鐘后, 噬菌體沉淀物重新懸浮于TBS 緩沖液( 50mM Tris-HCl[pH7.5], 和150mM NaCl). 并可用于下一輪的篩選.

DNA測序
培養(yǎng)了一個晚上的 E.coli ER 2738 用LB培養(yǎng)基稀釋成1: 100, 并分成1毫升的小等份. 加入能顯示Bcl-2結(jié)合肽的單個噬菌體. 細胞在37C培育5 小時, 然后離心收集含有噬菌體的上清液. 加入200微升PEG/NaCl(20% [W/V] 聚乙二醇-800 和 2.5M NaCl)以沉淀噬菌體. 用碘緩沖液(含10mM Tris-HCl[pH8.0], 1mMEDTA, 4MNaI) 重新懸浮由此產(chǎn)生的沉淀, 然后用酒精沉淀. 噬菌體的單鏈DNA由此獲得并溶于dH2O(蒸餾水), 噬菌體的單鏈DNA序列用擁有96 Pill測序引物的自動序列測定服務(Macrogen 公司, 首爾, 韓國)測定. 用新英格蘭生物實驗室提供的遺傳密碼資料推測出肽的氨基酸序列.

酶聯(lián)免疫吸附試驗估計結(jié)合親和力:
制備能表達Bcl-2 結(jié)合肽的噬菌體, 并以測量噬菌體形成單位(pfu)來決定其濃度, 當進行肽結(jié)合親和力估計時, 表達Bcl-2結(jié)合肽的噬菌體被如同指出的以濃度依賴方式加入含有Bcl-2蛋白(0.5微克/孔)的96孔平板. 隨后用TBST洗這些孔10次. 室溫下用一個抗-M13抗體(鼠單克隆抗體, 1:5000稀釋于TBST, 0.2微克/毫升, Amersham生物科學公司)探查1 小時. 用TBST 緩沖液洗5次后, 抗鼠IgG-辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合物被加進并培育1小時. 用TMB底物溶液(3,3’,5,5’-四甲基苯唑啶[TMB]/過氧化氫, Chemicon公司, 比爾里卡, 麻州)進行顯色反應. 15分鐘后, 加入1 M硫酸以終止反應. 用一個Biotrak 多孔平板閱讀儀(Amersham,生物科學) 在450nm處測定光密度. 另外, 一系列稀釋的用生物酰化的/或FITC-標記的肽被Bcl-2蛋白固定于96孔平板培育 2小時.結(jié)合到靶蛋白的生物酰化的肽通過與鏈霉親和素-HRP抗體共育(稀釋在1:1000TBST, BD Pharmingen, 圣迭戈, 加州)而檢測出來. 而FITC-標記的肽的結(jié)合親和力由有一在495nm激發(fā)和在520 nm發(fā)射的最大軟V5系統(tǒng)的熒光微板閱讀儀(Molecular Devices, 桑尼維爾, 加州)測定.

美中藥源原創(chuàng)文章，轉(zhuǎn)載注明出處并添加超鏈接，商業(yè)用途需經(jīng)書面授權(quán)。
★更多深度解析訪問《美中藥源》~

★ 請關(guān)注《美中藥源》微信公眾號 ★