CCR2拮抗劑對人類原發(fā)性單核細胞（增多癥）的高含量分析

2012年11月5日 | Filed under: 新藥研發(fā),推薦技術,文獻綜合 | Posted by: 朱貴東

【應用范圍】: 炎癥
【理由】: 單核細胞趨化蛋白 1 (MCP-1) – 驅動CC型趨化因子受體 2 (CCR2)活化是一個誘導單核細胞向炎癥中心遷移的早期關鍵步驟之一.

本實驗使用部分自動化液體處理, 自動熒光顯微成像, 及一個特異的圖像分析算法來分析內(nèi)在的MCP -1進入人類單核細胞. MCP -1熒光標記形式被單核細胞快速地吞噬并保留. 內(nèi)在的MCP -1 的CCR2依賴性同過BMS CCR222, CCR2 特異性的拮抗劑的使用而證明. 一系列小分子CCR 2拮抗劑的明顯抑制能力被測定, 并用5 種檢測格式進行比較, 包括在本項工作中所描述的高含量分析測定. 有趣的是, 在五個讀數(shù)系統(tǒng)中, 一些, 但并非全部的拮抗劑顯示出明顯不同的抑制行為. 其中在最高和最低的明顯抑制能力之間的差異, 最高可超過100倍. 這些發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了明顯的可能性, 即一些CCR2拮抗劑能在CCR2受體不同的功能狀態(tài)之間進行辯別. 并提出對于非選擇性拮抗劑而言,功能性選擇的CCR2拮抗劑將增加治療性的優(yōu)勢的策略.

【實驗材料】：
Ficoil-Paque PLUS (貨號17144002) 來于GE Healthcare Bio-sciences (Little Chalfont UK). 單核細胞分離試劑盒II (貨號130091153) 和磁珠分離LS色譜柱(貨號130042401) 均購自Miltenyi Biotec(Auburn, CA). 杜爾貝科磷酸鹽緩沖液(PBS)無鈣無鎂(1XD_PBS, 貨號H15-002)是從PAA Laboratories (Pasching, Austria). EDTA (Versen)1% (W/V) 在無鈣無鎂的PBS(貨號L2113)及在有鈣有鎂的PBS (貨號稱L1815). 雜交瘤DIF1000(貨號F8055)來于Biochrom AG(Berlin, Germany). 牛血清白蛋白(BSA, 貨號A8327 和A3059),皂素(貨號54521), 碳酸氫鈉溶液(7.5%[W/V], 貨號58761),甲醛(37%[W/V]水溶液, 貨號252549) 均購自Sigma Aldrich (St.Louis, MO). BD CellFIX 溶液購自BD Biosciences (BD；Franklin Lakes, NJ). 此外, 漢克氏緩沖鹽溶液(10X HBSS; 貨號14065-049), 1Ｍ４-［２-羥乙基］-１-哌嗪-乙醇磺酸（HEPES［肝素鈉］，貨號15630-056）．杜爾貝科＇氏PBS　含鈣和鎂（１ＸＤ-PBS，貨號14190-094），和Hoechst 33342(10毫克/毫升, 貨號H3570)購自Invitrogen (CarIsbad, CA). 血色染色盒(貨號1.1674.0001) 購于Merck Chemicals (Darmstadt, Germany). 無標記的人類單核細胞趨化蛋白-1(hMCP-1/CCL2;, 貨號300-04) 購于Pepro Tech Gmb4 (Hamburg, Germany), 125I-標記的hMCP-1(貨號NEX332005; 特異活性81.4 TBq/nmol)購自Perkin Elmer Life and Analytical Sciences(Waltham, MA). Alexa Flour 647-標記的hMCP-1(hMCP-1_AF647, 貨號CAF-02)購自Almac Sciences(Edinburgh, UK). 參考抑制劑BMS CCR2 22 (貨號3129)購于Tocris Bioscience (Bristol, UK). 藻紅蛋白(PE)-標記的鼠抗人類CD14抗體(貨號555398)從BD Biosciences 購得. OEHS-型(四極激發(fā)高靈敏度)音響HCA 閱讀儀購自Evotec Technologies (Hamburg, Germany, 現(xiàn)在是PerkinElmer Life and Analytical Sciences 的一部分). 細胞內(nèi)分析儀3000是購于GE Healthcare BioSciences(Little Chalfont, UK). BD 384 孔板(黑色/透明, 帶蓋的組織培養(yǎng)[TC]皿, 底部750微米,貨號350504). 一個定做的BD BioCoat 膠原 1 型細胞器皿, 384 孔厚底平板與細胞內(nèi)分析儀 3000成像配套都購自BD BioSciences, 而為音響HCA閱讀儀成像所定做的膠原 1 型涂層的384孔平板則購自Evotec Technologies. FLIPR 4 是從Molecular Devices(Sunnyvale , CA). Fluo-4 AM (貨號F1420)來于Invitrogen. 趨化測驗用的一次性趨化探針系統(tǒng)(5 微米孔徑, 貨號116-5) 購于Neuro Probe (Gaithersburg, MD),和 OptiPlate-96(貨號6005290)購自PerkinElmer Life and Analytical Sciences 與從Promega(Medison, WI) 購買的CellTiter-Glo 熒光細胞活性檢測(貨號G7571)結合使用. 至于125 I-hMCP-1hCCR2 SP A 結合試驗, 聚乙烯甲苯小麥胚芽凝集素閃爍珠(PVT-WGA珠, 貨號RPNQ0001)購于 GE Healthcare. 一株人類急性單核細胞白血病細胞(THP-1 細胞, DSMZ 號碼ACC16)獲自DSMZ 有限公司(Braunschweig, Germany). 這株THP-1細胞被培養(yǎng)在含有GlutaMAX 和25 mM 肝素鈉(貨號72400-021)的RPMI 1640培養(yǎng)基, 輔以1%(V/V)非必須氨基酸(NEAA, 貨號11140-035)及10%(V/V)小牛血清(FCS, 貨號稱0500-064)來于Invitrogen. 所有其它的材料都是市場上可以買到的最高等級.

半自動化hMCP-1_AF647在初級人類單核細胞的內(nèi)部檢測:
使用Ficoll-Paque Plus離心機把從徳國紅十字會在烏爾姆的血庫里獲得的人類棕黃色血清上層制備品用密度梯度離心方法分離出外周血單核細胞(PBMCs). 按照生產(chǎn)商提供的程序, 用單核細胞分離包II(購自Miltenyi Biotec)去掉非單核細胞(陰性選擇).無損的單核細胞由此而制備. 分離的單核細胞純度用制備的細胞離心涂片的Hemocolor染色來測定. 新鮮分離的單核細胞用一個有8個通道的吸量器置于涂有1型膠原蛋白的384孔測定平板(APs). 每孔 30微升測定緩沖液(1 X HBSS, 10mM肝素鈉, 0.0375%[W/V]碳酸氫鈉, 及0.1%[W/V]BSA), 細胞密度25,000細胞/孔. 用蓋子蓋住的APs在37C及5%(V/V)二氧化碳中培養(yǎng)60分鐘. 復合物來源的平板(CSPs)用在100% DMSO中的測試的化合物做一個3.16倍系列稀釋而制備. 之后, CSPs復合物被稀釋1:200于復合緩沖液(1X HBSS, 10mM 肝素鈉, 0.0375%[W/V]碳酸氫鈉), 再用CyBi-384孔同步吸液器(CyBio AG, Jena, Germany)放入復合緩沖液稀釋板(CBDP). 然后,用CyBi-384孔同步移液器把10微升/孔的稀釋的測試復合物從CBDP移到AP. 把AP放在室溫下培育30分鐘, 再以10微升/孔的量加入測試緩沖液里的hMCP-1_AF647, 調(diào)整hMCP-1_AF647 的濃度到10nM, 就象在這種情況下通過滴定hMCP-1_AF647到載體預處理的初級單核細胞的上清液進行測定那樣,這是這個試驗及HCA和全血測定的近似的EC值80. 隨后在5%[V/V]CO2及37C下培育一個指定的時間段或者象最后程序一樣培育45分鐘. 含有最終濃度為10nM hMCP-1_AF647和0.1%(V/V)DMSO的孔作為陽性對照(“高”),而輔以1uM參考拮抗劑BMS CCR2 22和10nM 激活劑的作為陰性對照(“低”). 細胞在室溫下用含4%甲醛的PBS固定,而核用1uM Hoechst 33342染色, 隨后細胞儲存于4C. 通過使用364-nm激光進行Hoechst 33342染料的熒光激活及647-nm激光激發(fā)AF647/hMCP-1信號而在IN Cell分析儀3000進行成像.

【圖像分析】:
hMCP-1_AF647內(nèi)部檢測:

IN Cell分析儀3000的熒光成像是用載于IN Cell分析儀3000的分析軟件粒度算法(GRN2)進行圖像分析. 簡言之,在藍色(核)通道中當像素積累超過一個特異的強度閾值時, GRN2算法識別核. 在這些核周圍, 一個特別擴張的”細胞質(zhì)”復蓋地區(qū), 一個預先設定的大小和強度的顆粒相對應于內(nèi)在的激動劑被鑒定. 這些顆粒的F值按以前描述的進行計算.

MCP-1誘導的在初級人類單核細胞胞質(zhì)內(nèi)鈣離子的增加：

初級人類單核細胞如同以上描述的從健康獻血者的緩沖液涂層的制備品中分離.在加入帶有鈣指示劑Fluo-4 AM的單核細胞后，細胞質(zhì)內(nèi)的鈣離子濃度的改變用ＦLIPR Tetra測定．其激發(fā)波長為４70-490 nM, 發(fā)射波長為515-575nM．熒光測量的頭２秒被用來檢測基線．移液系統(tǒng)適用于測定在培育１８０秒后不同濃度的復合物．然后，細胞用１0nM MCP-１處理（當測到細胞質(zhì)內(nèi)鈣離子增加時，測定的MCP-1的ＥＣ８０值是８nM, 為簡便，并增強這個測定與HCA和全血測定的一致性，選定１０nM增強劑．對以后的熒光標記的MCP-1結合的抑制的２種形式用ＥＣ８０值確定濃度）．測定復合物的明顯抑制能力的定量，　在加入MCP-1后信號強度被整合成８３秒．

ＴＨＰ－１細胞的趨化
由懸浮在檢測培養(yǎng)液（Hybridomed DIF 1000 含５％［Ｗ／Ｖ］ＨＳＡ在有鈣離子和鎂離子的ＰＢＳ里）的ＴＨＰ－１細胞于濃度為７Ｘ１０６細胞／毫升時進行趨化測定．用測試化合物處理過的細胞在指定的濃度下，５％［Ｖ／Ｖ］ＣＯ２，３７Ｃ３０分鐘．Ｃhemo TX 板的下層注入了測試培養(yǎng)液其中含有有趨化能力的hMCP-1（８００pm）ＥＣ８０．然后，　５００，０００被化合物處理過的細胞被置于聚碳酸酯過濾器的頂部．整個ChemoTX板被置于５％［Ｖ／Ｖ］ＣＯ２下在３７Ｃ培養(yǎng)３小時．測試化合物介導的趨化性拮抗通過使用CellTiter-Glo熒光活性檢測，測出在１００微升細胞懸浮液里的細胞數(shù)量進而確定趨化的拮抗作用。

在人類全血中hMCP-1_AF647 結合CCR2：
來于健康捐贈者的８４微升人類全血用１６微升ACD緩沖液（７５mM 檸檬酸鈉，３８mM檸檬酸，１２０mM葡萄糖，pH 6.5）抗凝．然后１微升不同濃度的測試化合物被加入，　混合物被培養(yǎng)在３７Ｃ加有５％［Ｖ／Ｖ］ＣＯ２１５分鐘．接下來，９９微升含有hMCP-1_AF647(最終濃度１０nM，即近似于ＥＣ８０的濃度，用滴定來確定就象在上面ＨＣＡ內(nèi)部測試中描述的那樣)的工作溶液加入，一種ＰＥ－標記的抗人類ＣＤＨ抗體（最終稀釋度為１：３６０）加入樣本，接著培養(yǎng)混合物于３７Ｃ含有５％｛Ｖ／Ｖ｝ＣＯ２條件下６０分鐘．將樣本離心(1200轉/分 5分鐘, 4C), 加入1200微升溶解溶液(155mM NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA)使紅細胞溶解, 隨后把混合物在冰上培育30分鐘. 在用HBSS(無鈣離子和鎂離子,補充有20mM肝素鈉, 0.2%[W/V]BSA, pH7.4)洗滌倆次后,剩余的細胞通過重新懸浮于BD CellFIX溶液(1:10稀釋于PBS)而固定. 用BDLSRII流動細胞儀及其633nm和488nm激發(fā)波長來測定細胞的熒光. 丟棄對PE-標記的CD14顯示陽性的細胞. 在這個群體中, 只有對hMCP-1_AF647顯示陽性的細胞才用BD FACS Diva軟件進行計數(shù)和分析.

放射性標記的hMCP-1 結合到THP-1細胞膜(閃爍近似檢測[SPA])
THP-1膜的粗糙膜制備品含有CCR2被用測試緩沖液(25mM 肝素鈉/氫氧化鈉,pH7.2, 5mM MgCl2; 0.5mMCaCl2; 和0.2% [W/V]BSA)調(diào)整到5微克蛋白質(zhì)/微升的濃度. PVT-WGA-SPA珠子則用測試緩沖液稀釋到8毫克珠子/毫升的濃度.

膜和珠子的準備: 細胞膜和珠子用1:2[V/V]的比例在室溫下用從一端到另一端的旋轉方式培育30分鐘.測試化合物用100%DMSO溶解到10mM的濃度, 再進一步用100%DMSO稀釋到1mM. 所有添加的化合物都用測試緩沖液稀釋. DMSO的最終稀釋濃度是1%[V/V].化合物和膜,珠懸浮液與100pM 125-IhMCP-1(<25,000cpm/10微升)一起培養(yǎng). 在無拮抗劑的情況下,80%的受體應該被飽和. 6 小時后,結合的放射活性用一beta計數(shù)器來確定. 試驗化合物的親和力通過實驗數(shù)據(jù)的曲線擬合及GraphPad Prism軟件版本4.03應用Cheng-Prusoff校正推導出一個明顯的分離平衡常數(shù)Ki 計算而確定.

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