一種鑒定靶點(diǎn)的新技術(shù)

2014年2月5日 | Filed under: 要聞點(diǎn)評(píng),文獻(xiàn)綜合 | Posted by: 編輯 D

作者：路人丙

昨天我們講了Sabry法則和找到靶點(diǎn)的重要性，現(xiàn)在絕對(duì)主流的研發(fā)模式是從一個(gè)確定的靶點(diǎn)開始研發(fā)項(xiàng)目，這時(shí)就沒有必要尋找靶點(diǎn)了因?yàn)榘悬c(diǎn)是已知的。但也有一些項(xiàng)目是通過臨床使用發(fā)現(xiàn)意外療效，或?qū)φw動(dòng)物尤其是細(xì)胞的特殊生物作用而開始的，這時(shí)為了在臨床甚至臨床前開發(fā)時(shí)遵守Sabry法則，找到靶點(diǎn)就很關(guān)鍵了。那么在實(shí)際工作中如何知道一個(gè)有療效的化合物是作用于哪個(gè)蛋白靶點(diǎn)呢？

找到一個(gè)有效化合物的靶點(diǎn)通常很復(fù)雜，尤其是表達(dá)不多的蛋白（而偏偏調(diào)控蛋白一般表達(dá)低于維持細(xì)胞基本功能的那些蛋白）或鑲嵌在細(xì)胞膜里的蛋白。常用的方法是把你有效的化合物接在樹脂上然后把細(xì)胞打碎后的蛋白混合物澆在樹脂上，洗洗涮涮之后理論上和你化合物作用最強(qiáng)的蛋白應(yīng)該留在樹脂上。然后再用過量的化合物把蛋白從樹脂上替換下來，通過質(zhì)譜或凝膠鑒定此蛋白姓字名誰。

這一期《Nature Chemical Biology》有一篇文章介紹一種新方法，叫做基于活性的蛋白鑒定（activity based protein profiling, ABPP）方法。這個(gè)方法只能用不可逆配體，即你的活性化合物必須得和作用蛋白發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，所以這個(gè)方法對(duì)于含有巰基的水解酶很適用。

鑒定過程是這樣的。首先你要通過細(xì)胞篩選一個(gè)化合物庫。這個(gè)化合物庫是由能和巰基反應(yīng)的化合物組成。作者觀察的細(xì)胞變化是脂蓄積，找到若干能促進(jìn)脂肪蓄積的化合物后，作者開始找哪個(gè)蛋白是這些活性化合物的靶點(diǎn)。他們先把細(xì)胞的蛋白混合物和其中一個(gè)活性化合物反應(yīng)，靶點(diǎn)蛋白因?yàn)楹瓦@個(gè)化合物結(jié)合強(qiáng)所以基本都和這個(gè)化合物形成共價(jià)結(jié)合物而其它水解酶則基本不和這個(gè)化合物反應(yīng)。然后作者又用一個(gè)熒光標(biāo)記的和所有水解酶都反應(yīng)的化合物和這個(gè)蛋白混合物反應(yīng)，因?yàn)榘悬c(diǎn)蛋白已經(jīng)和活性化合物反應(yīng)了，所以應(yīng)該不會(huì)被熒光標(biāo)記。在凝膠板上和對(duì)照一比沒有熒光的那個(gè)蛋白就是靶點(diǎn)。

另一個(gè)鑒定辦法是上述步驟的第二部用生物素標(biāo)記的水解酶抑制劑處理已經(jīng)和活性化合物反應(yīng)的蛋白混合物。然后用抗生物素蛋白樹脂把所有含生物素的蛋白挑出，剩下的蛋白用質(zhì)譜鑒定后既是靶點(diǎn)蛋白。

作者用這個(gè)方法找到兩個(gè)和脂代謝有關(guān)的水解酶CES3和CES1F,繼續(xù)根據(jù)這兩個(gè)靶點(diǎn)優(yōu)化這些先導(dǎo)物后作者找到一個(gè)可以在動(dòng)物緩解代謝綜合癥的化合物。非常優(yōu)秀的工作。

美中藥源原創(chuàng)文章，轉(zhuǎn)載注明出處并添加超鏈接，商業(yè)用途需經(jīng)書面授權(quán)。
★更多深度解析訪問《美中藥源》~

★ 請(qǐng)關(guān)注《美中藥源》微信公眾號(hào) ★